尼古丁对大鼠不同部位骨钙磷含量和碱性磷酸酶活性的差异影响

赵海霞 马肃 陈力 刘培红 徐晶 侯琳 陈蕊 秦春林

[摘要] 目的 分析尼古丁对大鼠牙槽骨和颌骨内钙磷含量以及碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法 将20只5周龄健康雄性Wistar大鼠随机分为实验组和对照组，实验组每天腹腔注射尼古丁0.73 mg·kg-1，对照组腹腔注射等量生理盐水，3个月后处死取材。浓酸消化法检测牙槽骨和颌骨内钙磷含量，改良Reddi法检测牙槽骨和颌骨内ALP活性。采用SPSS 16.0统计软件分别行独立样本的t检验。结果 与对照组相比较，实验组牙槽骨内和颌骨内钙磷含量均明显减少，差异均有统计学意义（P<0.05）；ALP活性无明显变化（P>0.05）。实验组中牙槽骨与颌骨比较，骨钙磷含量和ALP活性差异无统计学意义（P>0.05）。结论 尼古丁下调大鼠牙槽骨和颌骨内钙磷含量，对ALP活性的影响不明显。

[关键词] 尼古丁； 牙槽骨； 颌骨； 钙； 磷； 碱性磷酸酶

[中图分类号] R 781.4 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.002

流行病学研究显示：吸烟与牙周炎的普遍性、严重性及骨丧失关系密切；对牙周治疗有负面影响，常影响牙周治疗的效果。吸烟者牙周炎的临床体征明显有别于非吸烟者，如牙周探诊出血少、牙周袋深、牙槽骨丧失严重等[1-2]。

尼古丁作为烟草中的主要生物碱，能促进机体释放神经传导物质，限制抗体的产生，影响外周免疫调节T细胞；减少机体对钙的吸收从而导致骨质疏松，影响成骨和骨的矿化[3]。体外研究[4]发现尼古丁通过抑制成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和Ⅰ型胶原纤维（collagen type Ⅰ，COL1）的分泌从而抑制骨形成及矿化。但关于

尼古丁对骨形成和改建影响的体内研究尚缺乏相关报道，其机制尚不清楚。

骨形成过程包括成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。生物矿化则是指细胞合成和分泌有机基质后，钙和磷酸根不断沉积其中，当达到饱和度时，在基质上与非胶原蛋白结合形成磷酸钙晶核，晶核长大为晶体，与基质一起组成结构有序的矿化组织。矿化组织中的无机物主要是钙和磷，ALP在矿化组织细胞如成

骨细胞中高表达，是生物矿化的重要标记[5-7]。本实验拟通过定量检测腹腔注射尼古丁动物模型不同部位骨内的钙磷含量以及ALP活性的差异，初步探讨尼古丁对骨矿化的影响。

1 材料和方法

1.1 药物、试剂和仪器

尼古丁（北京伊普瑞斯科技有限公司），对硝基苯磷酸二钠（disodium 4-nitrophenyl phosphate，PNPP）

（Sigma公司，美国），电感耦合等离子体发射光谱仪（热电公司，美国），微波消解仪（型号MARS-5，培安公司，美国），电热恒温鼓风干燥箱（天津市中环

实验电炉有限公司），电子天平（型号AB204-s，梅特

勒公司，瑞士）。

1.2 动物的选择、分组和建模

选取由哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心提供的5周龄健康雄性Wistar大鼠20只为研究对象，体重为120～140 g。随机分为实验组和对照组，实验组每天腹腔注射尼古丁0.73 mg·kg-1，对照组腹腔注射等量生理盐水，常规饲养。

1.3 取材和组织生物化学检测

建模3个月后取材。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，在碎冰上解剖大鼠下颌骨后，除净附着的软组织，剪除切牙部分，获取下颌切牙区牙槽骨，同时剪取下颌支部分，分别用湿纱布包裹后，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.1 骨钙骨磷的测定 自-80 ℃冰箱取出大鼠左侧下颌牙槽骨和颌骨标本分别称湿重，利用阿基米德原理测定样本的体积，电热恒温箱烘干至恒重后进行以下测定。1）骨干重测定：电子天平称量，精确到0.000 1 g；2）骨矿物质测定：取钙标准溶液配

制成10、50、100、200、500×10-6的标准系列；取磷标准溶液配制成5、25、50、100、250×10-6的标准系列。每个样本分别置于消化罐中并加入1 mL去离子水、2 mL 30%过氧化氢、5 mL浓硝酸，同时设置空白对照，密闭后置微波消解仪中消化2 h，样本最后定容至25 mL，借用电感耦合等离子体发射光谱仪，光谱系为178.2条件下测定骨钙骨磷含量，求单位体积的骨钙骨磷含量。

1.3.2 ALP测定 自-80 ℃冰箱取出大鼠右侧下颌牙槽骨和颌骨样本分别称湿重，用改良Reddi法[8]，至匀浆机内加入冰预冷的生理盐水2 mL匀浆，10 000 r·min-1离心10 min。取上清液100 μL，加入1 mmol·L-1 PNPP 50 μL，37 ℃孵育15 min，加1 mol·L-1 NaOH 50 μL中止反应，在405 nm波长酶标仪下测定光密度（optical density，OD）值，计算单位体积的ALP。

1.4 统计学分析

采用SPSS 16.0统计分析软件对数据进行分析，对照组和实验组大鼠牙槽骨和颌骨内钙磷含量和ALP活性的数值行完全随机分组的独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对照组大鼠牙槽骨内钙磷总含量约占其重量的42%，钙/磷比值为2.36，ALP活性为1.679；颌骨内钙磷总含量约占其重量的41%，钙/磷比值为2.39，ALP活性为1.170。统计学结果显示：牙槽骨内钙磷含量与颌骨内钙磷含量比较差异无统计学意义（P=

0.079、0.180）；牙槽骨内ALP活性与颌骨内ALP活性比较有明显差异（P=0.041）（图1、2）。

图 2 尼古丁对大鼠牙槽骨和颌骨内ALP活性的影响

Tab 2 The effects of nicotine on the ALP activity in rat alveolar

bone and mandible

实验组大鼠牙槽骨内钙磷总含量约占其重量的40%，钙/磷比值为2.35，ALP活性为1.545；颌骨内钙磷总含量约占其重量的39%，钙/磷比值为2.41，ALP活性为1.013。统计学结果显示：实验组大鼠牙槽骨

内钙磷含量和ALP活性与颌骨内钙磷含量和ALP活性相比较差异无统计学意义（P=0.500、0.528、0.065）。与对照组大鼠相比较，实验组大鼠牙槽骨内和颌骨内钙磷含量均明显减少（P=0.010、0.020，P=0.034、0.019），ALP活性无明显差异（P=0.644、0.380）（图

1、2）。

3 讨论

3.1 动物模型的建立

大鼠因其价廉、易饲养、变量可控性好、骨骼系统的解剖结构和骨代谢与人类极为相似而被用于骨代谢的研究[9]。有学者[10]报告：70 kg体重的成人每天吸20支烟，摄入尼古丁的量约为0.15～0.18 mg·kg-1。根据药理实验方法学[9]提供的人与动物间表面积折

算的等效剂量比值，大鼠与人的比值为56.0，据此推算200 g大鼠用量约为人用量的1/6，经换算，此量相当于1人每天吸15支烟的尼古丁含量。侯秀敏等[11]对6周龄Wistar大鼠（160～180 g）进行被动吸烟2个月，结果表明烟草烟雾下调牙槽骨内牙本质基质蛋白1的表达，认为影响牙槽骨矿化。基于大鼠的生理特性，本实验选择5周龄Wistar大鼠（120～140 g）为研究对象，腹腔注射尼古丁（每天0.73 mg·kg-1）3个月，观察尼古丁对大鼠牙槽骨内和颌骨内钙磷含量以及ALP活性的差异影响。

3.2 正常大鼠牙槽骨内和颌骨内钙磷含量、ALP活

性及两部位间的差异表现

在骨的发生学上，牙槽骨和颌骨的形成均是膜内成骨，在即将成骨的部位由间充质细胞分化为成骨细胞[6-7]。成骨细胞通过基质小泡释放钙离子和ALP等酶类物质，钙离子在ALP作用下沉积在胶原纤维丝上，完成基质的矿化过程，最后形成矿化的骨小梁和平行的内、外板。骨组织化学成分的含量和结构受多种因素的影响，但钙磷含量比例基本一致，骨的钙/磷比值平均为2.33。在骨的组织结构上，牙槽骨疏松多孔，呈非均质性[12]；下颌升支颊侧皮质

骨较舌侧厚，松质骨于升支中份厚度最大，部分下颌升支无松质骨结构[13]。本实验结果显示：对照组

牙槽骨内钙磷总含量约占其重量的42%，钙/磷比值为2.36，ALP活性为1.679；颌骨内钙磷总含量约占其重量的41%，钙/磷比值为2.39，ALP活性为1.170。统计学结果显示：对照组大鼠牙槽骨内钙磷含量和颌骨内钙磷含量比较差异无统计学意义（P>0.05），牙槽骨内ALP活性与颌骨内ALP活性比较差异有统计学意义（P<0.05）。提示：在本实验周期内，健康大鼠

牙槽骨内钙磷含量略低于颌骨内钙磷含量，ALP活性高于颌骨内ALP活性，此结果可能与牙槽骨内松质骨含量较多、局部机械刺激等促进骨代谢有关。

3.3 尼古丁对不同部位骨内钙磷含量和ALP活性的

影响

Levin等[14]通过流行病学研究发现吸烟者牙槽骨的密度和高度明显低于非吸烟者。刘颍凤等[12]研究

表明尼古丁使鼠牙槽骨高度轻度降低并呈剂量依赖性，CT扫描发现骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度的值与尼古丁给药剂量呈负相关，骨小梁间隙值高于对照组。Kim等[15]研究发现随着尼古丁浓度的增加，矿化结节形成显著减少；低浓度时ALP活性与对照组无明显差异，随浓度的增加，ALP活性随之降低。研究[4]指出低浓度的尼古丁促进成骨细胞的增殖并提高ALP活性，促进Ⅰ型胶原的合成，但高浓度时则抑制细胞的增殖和骨的代谢。研究[4-5]还表明尼古丁参与成骨细胞的分化是由于尼古丁导致细胞膜的除极化，继而结合烟碱受体，激活电位依赖的Ca2+通道，通过钙离子信号途径而完成。本实验结果表明：在本实验周期内，实验组大鼠牙槽骨和颌骨内钙磷含量明显减少（P<0.05），ALP活性无显著性差异（P>0.05）；实验组大鼠牙槽骨和颌骨内钙磷含量和ALP活性均无明显差异（P>0.05）。结果显示尼古丁均下调牙槽骨和颌骨钙磷含量，却没有明显影响ALP活性，此结果可能与尼古丁浓度和实验周期有关。笔者推测尼古丁对成骨细胞的抑制作用并非完全通过降低ALP活性完成，可能通过钙化相关的非胶原蛋白参与完成。因此尼古丁对骨形成影响的分子机制还需要进一步的实验研究。

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（本文采编 王晴）