不同器具煎煮补阳还五汤的4种成分含量比较

张星，陆兔林，毛春芹，蔡宝昌，顾娟娟，弓晓东，胡俊扬，吴杨 （.南京中医药大学江苏省中药炮制重点实验室，江苏 南京0046；.南京中医药大学药学院，江苏 南京0046）

补阳还五汤出自《医林改错》下卷，由清代名医王清任所创制［1］，由生黄芪、当归尾、赤芍、川芎、桃仁、地龙、红花组成，具有补气活血、化淤通络之功效，主要用于治疗半身不遂，遗尿不禁等气虚血淤证，是临床治疗老年中风症常用经验方剂。众所周知，中药的煎煮方法及煎药器具直接影响中药的质量及疗效。目前，市场上有关汤剂煎煮的器具种类繁多，比如砂锅、搪瓷锅、不锈钢锅等，甚至有人仍使用铝锅或铁锅煎煮中药，致使药物疗效降低，因为铝、铁、铜的金属活性较强，很可能与中药中的某些成分起化学反应，这种化学反应可使药物中的某些有效成分发生沉淀，生成对人体有害的物质［2］。传统煎药一般通用的是有盖的陶瓷砂锅，还有部分人使用全自动煎药壶及不锈钢锅等。本实验以测定不同器具煎煮的补阳还五汤中多成分含量评价各个煎煮器具的优劣，优选最佳的煎煮器具，为临床汤剂煎煮规范提供可靠依据。

现有文献报道该方的主要活性成分包括黄酮类、挥发油及多糖等［3］，其中以黄芪中的黄酮类成分含量较高，如毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素等，且黄酮类成分具有抗心肌缺血、抗炎、清除自由基等药理作用［4］，桃仁中的苦杏仁苷具有活血祛淤之功［5－7］，赤芍中的芍药苷有镇静、抗过敏、血管扩张等药理作用［8－10］。本文建立了用HPLC同时检测补阳还五汤中苦杏仁苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素4种有效成分含量的方法［11－13］，并应用该法评价优选补阳还五汤最佳煎煮器具，为补阳还五汤临床煎煮应用提供了可靠依据，从而更加全面、有效的控制其质量，保证其疗效。

1 材料

Agilent 1100高效液相色谱仪；KQ－500B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA1104型万分之一电子分析天平（上海天平仪器厂）；HH－S型水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；砂锅（景德镇嘉宝瓷业发展有限公司）；不锈钢锅（美的集团有限公司）；全自动中药壶（广东潮州奇巧贸易有限公司）。

苦杏仁苷对照品（批号820－200002）、芍药苷对照品（批号110736－201035）、芒柄花素对照品（批号111703－200501）均购自中国食品药品检定研究院；毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号110796－201017，购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于99%）；补阳还五汤的样品和阴性样品均自制；黄芪、当归、赤芍、红花、川芎、桃仁、地龙均购自江苏海昌中药饮片有限公司，经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，符合中国药典2010 年版一部相关规定，均为正品饮片；乙腈（美国Tedia公司）、甲醇（上海凌峰化学试剂公司）为色谱纯，水为二次重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统试用性试验 采用依利特Hypersil ODS2色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱，具体梯度见表1，流速为1mL·min－1，检测波长为218nm，柱温为30℃，进样量10μL，分析时间为80min。

表1 梯度洗脱顺序Tab 1 Gradient elution of mobile phase

2.2 对照品溶液的制备 分别称取苦杏仁苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芒柄花素对照品适量，加甲醇配制成每1mL 分别含苦杏仁苷0.938 mg、芍药苷0.977 mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.864 mg、芒柄花素0.44mg的单个组分对照品溶液。

分别精密量取上述单个组分对照品溶液至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配成每1mL 分别含苦杏仁苷0.187 6mg、芍药苷0.195 4mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.172 8mg及芒柄花素0.088mg的混合对照品液。

2.3 供试品溶液的制备 分别取补阳还五汤一剂处方量的饮片（黄芪120g，当归6g，赤芍5g，川芎、红花、桃仁、地龙各3g）于砂锅、不锈钢锅、全自动中药壶中加相当于饮片10倍量的水，浸泡30min，砂锅、不锈钢锅明火加热煎煮30 min，全自动中药壶无明火加热煎煮30min，各煎煮2次（2次加水比例6∶4），两层纱布过滤，合并滤液，浓缩，定容至300 mL。实验平行操作5次。

精密量取补阳还五汤浓缩液20mL，水浴蒸干，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定，超声处理30 min，取出，放冷至室温，称定，加甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液，过0.45μm 的微孔滤膜。

2.4 阴性对照溶液的配制 按处方比例分别称取除黄芪、赤芍、桃仁以外的其余药味，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法操作制成缺黄芪、缺赤芍、缺桃仁的阴性对照溶液。

2.5 专属性试验 分别取混合对照品溶液，供试品溶液及阴性对照溶液，按上述色谱条件进样分析，液相色谱图见图1。阴性样品在指标成分苦杏仁苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素的色谱峰位置上无吸收，表明该方法的专属性良好。

图1 补阳还五汤的HPLC色谱图A.混合对照品；B.补阳还五汤样品；C.阴性样品；1－苦杏仁苷；2－芍药苷；3－毛蕊异黄酮葡萄糖苷；4－芒柄花素Fig 1 HPLC chromatograms of Buyang Huanwu decoctionA.mixed reference substance；B.samples；C.negative sample；1－amygdalin；2－paeoniflorin；3－calycosin glucoside；4－Formononetin

2.6 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液0.2，0.5，1，2.5，5 mL 至5 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，分别进样分析，进样量10 μL 记录峰面积。以峰面积Y 对进样量X（mg·mL－1）进行线性回归，求得苦杏仁苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芒柄花素的回归方程、相关系数和线性范围，结果见表2。

表2 4种有效成分的线性方程、相关系数及线性范围Tab 2 Regression equation，correlation coefficient and linearity range of 4compounds

结果表明，苦杏仁苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芒柄花素的含量分别在0.007 5～0.187 6 mg·mL－1、0.007 8～0.195 4mg·mL－1、0.006 9～0.172 8mg·mL－1、0.003 5～0.088 0mg·mL－1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验 取上述对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，记录苦杏仁苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芒柄花素峰面积，并计算其RSD分别为0.95%，0.84%，1.09%，1.62%，结果表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 精密量取砂锅煎煮的补阳还五汤样品1份，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，20h测定样品中各组分的峰面积，计算苦杏仁苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芒柄花素峰面积的RSD 分别为0.75%，1.34%，2.02%，1.78%，表明供试品溶液在20h内稳定。

表3 不同器具煎煮对补阳还五汤4种成分的含量的影响（mg·g－1，n＝5）Tab 3 Influence of different boiling apparatus on the contents of the four ingredients of Buyang Huanwu decoction（n＝5）

2.9 重复性试验 精密量取砂锅煎煮的补阳还五汤样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品液，进样10μL，记录峰面积，并计算含量。结果样品中苦杏仁苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素平均含 量 分 别 为7.7869，4.503，0.4996，0.0782 mg·g－1，RSD 分别为0.62%，0.17%，0.62%，0.10%，表明该方法重复性良好。

2.10 准确度试验 精密量取砂锅煎煮的补阳还五汤样品9份，每份10mL，置具塞锥形瓶中，水浴蒸干，根据样品中苦杏仁苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芒柄花素含有量的80%，100%，120%，分别加入混合对照品溶液（含苦杏仁苷0.667 4 mg·mL－1、芍药苷0.349 8 mg·mL－1、毛蕊异黄酮葡萄糖 苷1.328 7 mg·mL－1、芒 柄 花 素0.126 5 mg·mL－1）0.8，1，1.2mL，各3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。结果苦杏仁苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素的平 均 回 收 率 分 别 为99.35%，98.75%，101.65%，101.63%，RSD 分 别 为0.21%，0.24%，1.03%，0.62%。

2.11 样品含量测定 取3种不同器具煎煮的的补阳还五汤共15份（每种平行5份），按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，以一剂处方生药总量计算，结果见表3。

由表3经过t检验可见，砂锅煎煮组补阳还五汤药液中4种成分含量均与不锈钢锅组及全自动中药壶组有显著性差异（P＜0.01），说明使用传统砂锅煎煮补阳还五汤最佳；而不锈钢煎煮组与全自动中药壶组差异也具有显著性（P＜0.01），说明使用不锈钢煎煮补阳还五汤有效成分含量最低。

3 讨论

补阳还五汤成分复杂，其主要有效成分的紫外吸收差异很大，通过HPLC 在210，218，230，260，300nm 波长下检测，结果表明在218nm 处有被测各种成分均能出峰，260nm 以上芍药苷被测灵敏度大大降低，苦杏仁苷基本检测不出。为使各组分在同一波长下都能有较好吸收，达到吸收强、干扰小的目的，故选择218nm，从而实现对4个成分的同时测定，以全面评价汤剂的质量。

本文通过同时测定补阳还五汤中4种有效成分的含量优选其最佳煎煮器具，得出砂锅效果最好。造成如此结果的原因可能是砂锅煎煮中药是使用明火加热，受热均匀，升温速度相对较慢，煎出药液性质稳定且煎汁较浓，故有效成分含量较高；全自动中药壶虽然也是搪瓷制品，但是属于无明火加热，受热不均；而使用不锈钢锅煎煮中药，因为是金属质地，所以升温速度过快，饮片受热不均，煎汁色泽较淡且性质不稳，故所测有效成分含量最低。

本实验研究得出采用传统砂锅煎煮补阳还五汤有效成分含量最高。煎煮器具对中药汤剂质量及疗效的影响目前研究还属于初步阶段，本实验为其进一步研究提供了可靠地理论依据，同时也为临床汤剂煎煮技术的规范化提供了有力的科学参考。

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