延龄草不同提取部位总酚的含量测定

黄华斌，万仲贤，漆立军 （恩施州中心医院，湖北 恩施445000）

延龄草，又名头顶一颗珠，来源于百合科植物延龄草（Trillium tschonoskii Maxim）的果实、根茎及根，在湖北主要分布于恩施巴东县、神农架自然保护区、十堰郧县等地，是颇具土家族特色的草药［1－3］。延龄草在土家族医药中被收载为镇静安神药和跌打损伤药，可治疗头晕、失眠、跌打损伤、外伤出血［4－7］。近年来，由于药源问题得到解决［8］，延龄草 的 开发日益受到重视。现代研究显示，延龄草具有显著的体内抗氧化活性［9－12］，但目前其抗氧化物质基础还不明确。酚类化合物是具有良好抗氧化活性的一类化合物，福林酚法是根据酚羟基的还原性、酚羟基数目与氧化试剂形成的有色化学物质的量在一定范围内呈线性关系的一种方法，因此本文采用福林酚法测定延龄草不同提取部位中的总酚含量，初步探讨其抗氧化、延缓衰老的物质基础。

1 材料

1.1 仪器 RE－2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DLSB－5／20低温冷却循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；752紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 试药 延龄草来源于恩施州中心医院中药房，经本院黄华斌副主任药师鉴定为百合科植物延龄草（Trillium tschonoskii Maxim）的根茎及根；超纯水；10%福林酚试剂（Sigma公司，美国）；没食子酸（中国食品药品检定研究院，批号100708－201002，含量为99.97%）；乙醇、甲醇、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、碳酸钠均为分析纯（上海国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 样品的制备

2.1.1 延龄草不同提取部位的制备 称取干燥延龄草0.5 kg，适度切碎，以75%的乙醇浸泡过夜后回流提取2次，每次1h，合并提取液，滤过，减压浓缩，即得延龄草的乙醇总提取物（TE－TM）。乙醇总提取物加水充分混悬后，按体积1∶1（乙醇提取物的水溶液∶萃取溶剂）依次经过石油醚、醋酸乙酯、正丁醇，分别各萃取3次，合并各萃取液，60℃水浴蒸干，得石油醚部位（PE－TM）、醋酸乙酯部位（EE－TM）、正丁醇部位（BE－TM）、水部位（WE－TM）的浸膏。

2.1.2 供试品溶液的制备 取延龄草乙醇总提物及4个不同溶剂提取部位浸膏各10 mg，精密称定，置100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并制成质量浓度分别为0.1 mg·mL－1的溶液，作为供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸10.02 mg，置250mL量瓶中，以适量甲醇溶解，定容，精密量取50mL，采用倍半稀释法制成质量浓度依 次为40，20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.312 5μg·mL－1的没食子酸甲醇溶液，备用。

2.2 福林酚法测定条件的优化 均采用单因素试验，研究福林酚试剂用量、20%碳酸钠溶液用量、反应温度、反应时间对吸光度值的影响，以建立最佳的实验条件。

2.2.1 10%福林酚试剂用量的确定 在对照品溶液为2.5 mL、20%碳酸钠溶液为200μL、反应温度为40 ℃、反应时间为3h的条件下，研究不同量（0.5～4.0 mL）福林酚试剂对吸光度值的影响。结果见图1。由图1可见，当福林酚试剂加入量为2.5mL和3mL时，吸光度值最大，因此，10%福林酚试剂的最佳用量为2.5mL。

2.2.2 20%碳酸钠溶液用量的确定 在对照品溶液为2.5 mL、10%福林酚试剂为2.5mL、反应温度为40 ℃、反应时间为3h的条件下，研究不同量的20%碳酸钠溶液对吸光度值的影响。结果见图2。由图2可见，当20%碳酸钠溶液体积达到150μL时，吸光度值最大，显色反应完全，当达到170 μL时，反应体系产生沉淀，提示碳酸钠过量，故20%碳酸钠溶液最佳反应体积为150μL。

图2 20%碳酸钠用量对吸光度值的影响Fig 2 Effect of 20% Na2CO3reagent dosage on absorbance value

2.2.3 反应温度的确定 在对照品溶液为2.5mL、10%福林酚试剂为2.5mL、20%碳酸钠溶液为150μL、反应时间为3h的条件下，研究不同温度（15～45 ℃）对吸光度值的影响。结果见图3。由图3可见，在30 ℃时吸光度值最高，提示：30 ℃是最佳的反应温度。

图3 反应温度对吸光度值的影响Fig 3 Effect of reaction temperature on absorbance value

2.2.4 反应时间的确定 在对照品溶液和10%福林酚试剂各为2.5mL、20%碳酸钠溶液为150μL、反应温度为30 ℃的条件下，研究不同反应时间（0.5～4h）对吸光度值的影响，结果见图4。结果表明，反应2h后其吸光度值达到最大值，且随时间的延长吸光度值基本维持稳定，故确定2h为最佳的测定时间。

图4 反应时间对吸光度值的影响Fig 4 Effect of reaction time on absorbance value

2.3 测定波长的选择 取对照品溶液3.5mL，置比色皿中，在波长范围500～900nm 范围内全波长扫描，测得没食子酸的最大收波长为765nm，结果见图5。因此设定765nm 为测定波长。

图5 没食子酸紫外吸收光谱图Fig 5 The ultraviolet spectrum of gallic acid

2.4 标准曲线的建立 精密量取质量浓度为0.312 5，0.625，1.25，2.5，5，20，40μg·mL－1的没食子酸对照品溶液各2.5mL，分别置25 mL 量瓶中，在“2.2”项下优化的条件下，反应2h后采用紫外分光光度法，在765nm 处测定吸光度，以对照品质量浓度（mg·L－1）为横坐标，吸光度为纵坐标，按浓度与吸光度相关关系求回归方程为：Y＝0.051 85 X－0.007 93，r＝0.999 3，没食子酸在0.312 5～40mg·L－1的范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.5 方法学考察

2.5.1 显色反应稳定性试验 “2.2.4”中反应时间的考察中已经得出，反应在达到2h后趋于稳定，此后，随着反应时间的延长而吸光度值基本保持不变。

2.5.2 仪器精密度试验 精密量取对照品溶液2.5mL，置25mL量瓶中，按“2.2”项下确定的最佳试验条件，在765nm处定吸光度，重复6次，测得吸光度平均值为0.120，RSD 为0.45%。

2.5.3 重复性试验 精密称取延龄草乙醇总提取物适量，按照供试品溶液的制备方法，平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下确定的最佳条件，在765nm 波长下测定吸光度，测得延龄草乙醇总提取物中总多酚平均含量为9.53%，RSD为0.49%。

2.5.4 加样回收率试验 分别精密称取延龄草乙醇总提取物6份，每份精确加入一定量的没食子酸，按供试品溶液制备项下同法制成供试品溶液，在“2.2”项下确定的最佳试验条件下，在765nm 波长处测定吸光度，计算加入没食子酸回收率，结果见表1。

2.6 样品的测定 精密量取“2.1.2”项中制备的样品溶液2.5mL，置25mL量瓶中，按确定的最佳试验条件下，在765 nm 波长处测定吸光度，重复3次，以每毫克提取物中所含的没食子酸量来表示各个部位中总酚含量。结果见图6。

图6 延龄草不同提取部位中总酚的含量（n＝3）Fig 6 Total phenol content of the extractions from TM（n＝3）

3 讨论

由图6可知，延龄草的乙醇总提物及4个不同提取部位的总酚含量存在显著差异。其中乙醇总提取物中总酚百分含量为9.53%，醋酸乙酯部位中总酚百分含量为27.23%，其次正丁醇部位为19.05%，而石油醚部位为3.68%，它们总酚含量高低顺序为：EE－TM＞BE－TM＞TE－TM＞WE－TM＞PE－TM，这说明延龄草中总酚含量较高，且主要集中在醋酸乙酯部位和正丁醇部位中。

同时，本研究还发现在用福林酚法测定总酚含量时需要对实验条件进行考察和优化，实验需要通过单因素实验来确定福林酚试剂、碳酸钠溶液的用量、反应时间及反应温度对吸光度的影响。而实验中福林酚试剂和碳酸钠溶液用量的多少可能与待测样品总酚含量、福林酚试剂和碳酸钠在反应中物量关系有关。

总之，本实验初步探明延龄草总酚的含量及分布，证实了延龄草具有较大的抗氧化能力，确定了其抗氧化的物质基础，为后续研究提供了一定的依据和基础。

［1］ 中国科学院植物研究所.中国植物志［M］.第13卷.北京：科学出版社，1978：97.

［2］ 瞿显友，秦松云，田华永.土家族药用植物资源研究［J］.中国民族医药杂志，2007，2：37－40.

［3］ 林先明，廖朝林，郭杰.延龄草生物学特性研究［J］.中国现代中药，2006，8（7）：38－41.

［4］ 赵敬华.土家族医药学概论［M］.北京：中医古籍出版社，2005：150.

［5］ 杨德胜.土家族药学［M］.西宁：青海人民出版社，2009：307.

［6］ 方志先，朱诗立.恩施州民族医药研究丛书·恩施本草精选［M］.北京：国际文化出版公司，2002：302.

［7］ 赵敬华.恩施州民族医药研究丛书·恩施州名中医医案集［M］.北京：国际文化出版公司，2002：10.

［8］ 张国华，廖朝林，林先明，等.延龄草栽培技术［J］.现代农业科技，2008，37（8）：19－20.

［9］ 袁杰.头顶一颗珠对大鼠缺血再灌注后左心室功能及抗氧化酶的影响［J］.临床合理用药，2009，2（11）：31－32.

［10］覃亚云.头顶一颗珠水煎液对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用［J］.中外健康文摘，2009，8（8）：214－215.

［11］黄丽亚.延龄草何首乌对氟哌啶醇致痴呆大鼠抗氧化酶表达作用的研究［J］.浙江中医杂志，2006，41（7）：430－431.

［12］黄丽亚，张晓红.延龄草注射液上调抗氧化酶表达作用的实验研究［J］.湖北中医杂志，2006，28（9）：7－8.