环孢素A固体自微乳的制备及评价

白中稳，胡容峰，3，孙备，胡晓 （1.安徽中医学院药学院，安徽 合肥230031；2.安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥230038；3.安徽省“115”现代中药研发创新团队，安徽 合肥230038；.安徽省药物研究所，安徽 合肥230022）

环孢素A（cyclosporin A，CsA）是由11个氨基酸组成的环状多肽［1－2］，属于选择性作用于T 淋巴细胞的强效免疫抑制剂，主要用于预防移植术后的移植物抗宿主反应，并于1978 年用于人体器官移植。环孢素软胶囊于1983年在瑞士上市，目前已在全球广泛使用。

固体自微乳与自微乳相比，稳定性增加、胃肠道刺激性减少、服用方便［3］。作为难溶性药物的载体，可以提高药物溶出度、生物利用度，降低胃肠道不良反应［4］。目前自微乳固化技术主要有喷雾干燥、冷冻干燥、固体载体吸附。自微乳含有的油相及表面活性剂黏度较大，喷雾干燥收率低［5］；冷冻干燥对仪器设备有较高要求，成本高，生产复杂［6］；固体载体吸附需加入大量载体赋形剂，所得固体载药量低且黏性大，有的固体还需要制粒过程，后续处理复杂［7］。

球晶技术是指利用辅料或药物在不同溶剂中溶解度的差异，通过转换溶剂和控制适宜的条件，使药物在重结晶过程中以球形或近似球形相互集聚析出，从而获得良好的后续处理特性和满意的生物利用度的方法。该方法在液相中一步完成制粒，改善了物料粉体学性质，大大简化了传统制粒工艺，可直接用于压片。本课题采用球晶技术制备乙基纤维素多孔微球，联合二氧化硅对CsA 自微乳吸附固化，拟制备载药量高、粉体学性质好的CsA 固体自微乳。以市售环孢素软胶囊（Neoral®）为参比制剂，研究自制CsA 固体自微乳（CsA－SSEDDS）在大鼠体内的药动学行为，评价两制剂的相对生物利用度，为人体药动学研究提供参考。

1 材料

高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SPD－10AVP型紫外检测器；Kromasil C18柱（150 mm×4.6mm，5μm）；混匀器（Fisher Scientific，Touch Mixer Model 231）；TG16－WS 台式高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；KQ2200型超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）。

CsA 固体自微乳（自制，批号20120730）；环孢素软胶囊（瑞士诺华制药有限公司，批号S0157）；其他试剂均为分析纯或色谱纯。

健康SD 雄性大鼠，体质量（450±20）g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物合格证号：SCXK（苏）2009－0001。此次动物实验已经过安徽中医学院动物伦理委员会批准进行。

2 方法与结果

2.1 CsA 固体自微乳的制备

2.1.1 CsA 自微乳 基本处方［8］：CsA 1.0g，聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH40）5.0g，辛酸癸酸三甘油酯（GTCC）2.0g，PEG 400 2.0g，无水乙醇1.0g。精称各品，将RH40水浴加热至完全熔化（约55 ℃）；将CsA 溶于无水乙醇中，依次加入GTCC、RH40、PEG 400，用玻璃棒轻轻搅拌即得。

2.1.2 乙基纤维素多孔微球 采用球晶技术制备乙基纤维素多孔微球［9］。基本处方：乙基纤维素500mg，二氯甲烷6 mL，PEG 400 100 mg，0.08%SDS 125mL。精称各品，将乙基纤维素溶于二氯甲烷中，加入致孔剂PEG 4000溶解或混悬，将此溶液在25 ℃和转速500r·min－1条件下，倒入0.08%SDS溶液中。搅拌30min后，水洗，干燥。

2.1.3 CsA 固体自微乳 采用固体载体吸附法制备CsA 固体自微乳［7］。以固化后置于滤纸上无印迹为完全固化，以固化后固体自微乳的形态、流动性、载药量为评价指标，分别采用自制乙基纤维素多孔微球、二氧化硅、微晶纤维素、甘露醇、乳糖中的一种或几种，对CsA 自微乳吸附固化。

单独固化时，乙基纤维素多孔微球固化后所得固体流动性最好，但载药量较低；二氧化硅固化，用量最少，载药量最大，但所得固体黏性较大。联合固化时，以乙基纤维素多孔微球与二氧化硅共同固化结果最好。综合以上因素，最终处方选择：CsA 自微乳－乙基纤维素多孔微球－二氧化硅为4∶2∶1。

基本处方：CsA 自微乳1.0g，乙基纤维素多孔微球：0.5g，二氧化硅：0.25g。精称各品，将乙基纤维素多孔微球加入到CsA 自微乳中，边加边搅拌，然后加入二氧化硅，边加边搅拌，即得CsA 固体自微乳。

2.2 CsA 固体自微乳的质量评价

2.2.1 CsA 自微乳固化前后乳剂性质 固体自微乳进入体内能自乳化形成微乳，自微乳固化后在体内能否仍以微乳形式释药，是本实验探讨内容之一。Zeta电位是微粒分散体系物理稳定性的重要评价指标之一，可以用来表示带电微粒间相互作用力大小；一般粒径较小，口服后能快速地通过胃肠道黏膜，更易被吸收［10］。

取固化前液体CsA 自微乳、固化后CsA 固体自微乳各1.0g，分别加入到37 ℃200mL 0.1mol·L－1盐酸中，在磁搅拌器的作用下，以100r·min－1的速度搅拌，用Malvern粒径测定仪分别测定CsA自微乳、固体自微乳的粒径及Zeta电位。

由图1、表1 可知，固化前CsA 自微乳平均粒径 为（27.2±0.7）nm，Zeta 电 位（－2.0±0.8）mV，固化后CsA 固体自微乳平均粒径为（29.4±0.8）nm，Zeta电位（－2.3±0.6）mV，固化前后，粒径、电位变化较小，说明固化过程中，自微乳未被破坏，自微乳固化后在体内能以微乳形式释药。

表1 CsA 自微乳吸附前后平均粒径、电位测定结果（±s，n＝5）Tab 1 Particle size，Zeta potential of CsA self－microemulsion and CsA solid self－microemulsion in 0.1mol·L－1 HCl（±s，n＝5）

表1 CsA 自微乳吸附前后平均粒径、电位测定结果（±s，n＝5）Tab 1 Particle size，Zeta potential of CsA self－microemulsion and CsA solid self－microemulsion in 0.1mol·L－1 HCl（±s，n＝5）

样品 粒径／nm Zeta电位／mV CsA 自微乳27.19±0.68－2.00±0.77 CsA 固体自微乳29.35±0.75－2.29±0.59

2.2.2 粉体学性质的测定［11］休止角是表示粉体流动性的最常用的方法之一。本实验将漏斗置于水平面放置，取一定量的待测物质，在一定振动强度下使CsA 固体自微乳微球均匀流出漏斗，直到获得最高的圆锥体为止，测量圆锥体斜面与平面的夹角即为休止角（angle of repose），重复测定5次，结果见表2。

卡氏指数反映物质的流动性能及填充性能。取一50mL量筒，精密称重。在一定强度振动下使待测物均匀由漏斗流入其中，精密称重，计算松密度ρ0；采用轻敲法使量筒中的物质处于最紧实状态，计算振实密度ρf。通过公式C＝（1－ρo／ρf）×100%计算卡氏指数，重复测定5次，结果见表2。

一般休止角小于30°流动性较好，小于40°可满足工业直接压片需要，轻敲密度低于0.35g·mL－1时，不适于直接压片。卡氏指数大则可压性好，反之流动性好，卡氏指数在15%～25%为佳［11］。

图1 CsA 自微乳吸附前后平均粒径、电位图A.吸附前CsA 自微乳粒径及电位；B.吸附后CsA 自微乳粒径及电位Fig 1 Particle size，Zeta potential of CsA self－microemulsion and CsA solid self－microemulsion in 0.1mol·L－1 HCLA.CsA self－microemulsion before the adsorption；B.CsA solid self－microemulsion after the adsorption

表2 CsA 固体自微乳粉体学性质测定结果（±s，n＝5）Tab 2 Results of the powder properties of CsA solid selfmicroemulsion（±s，n＝5）

表2 CsA 固体自微乳粉体学性质测定结果（±s，n＝5）Tab 2 Results of the powder properties of CsA solid selfmicroemulsion（±s，n＝5）

项目 结果休止角／° 29.2±0.8 松密度／g·mL－1 0.558 1±0.006 5振实密度／g·mL－1 0.683 6±0.010 1卡氏指数／%18.412 7±0.694 2

2.3 药动学参数计算和统计学处理

2.3.1 给药方案及样品采集 SD 大鼠12只，随机分成2组，空腹12h，第一组灌胃Neoral®（参比制剂），第二组灌胃自制CsA－SSEDDS（受试制剂），给药剂量以CsA计10mg·kg－1。于服药前（0h）和服药后10，20，30min和1，2，3，6，9，12，24h，用毛细管眼眶取血0.5mL。给药3h后，大鼠自由进食、进水。

2.3.2 全血样品预处理［12－13］全血0.5mL，加入0.1 mol·L－1氢氧化钠0.4mL，涡旋混合1min，再加入乙醚5mL，涡旋混合5min，4 000r·min－1离心10min，取上层乙醚层4mL，在50℃水浴中自然挥干。加乙醚1mL涡旋混合2min，50 ℃水浴自然挥干。然后加入甲醇－0.025mol·mL－1盐酸（1∶1）0.1mL，涡旋混合2min，再加入正己烷0.3mL，涡旋混合1min，4 000r·min－1离心5min，取下层至离心管中，最后加入正己烷0.3mL，涡旋混合1min，8 000r·min－1离心5min，吸取下层20μL进样。

2.3.3 体内分析方法的建立

（1）色谱条件：色谱柱为C18柱（Kromosil，250 mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇－水－磷酸（90∶10∶0.1）；流速为1.0 mL·min－1；检测波长为211 nm；柱温55 ℃；进样量20μL。

（2）方法的专属性：在上述色谱条件下，测得经预处理的大鼠空白血色谱图、空白血中加入CsA 对照品色谱图及大鼠给药后全血样品色谱图进行比较，结果表明，在选定的色谱条件下空白血中内源物质不干扰CsA 的测定，说明本方法具有较高的专属性。

图2 不同血样色谱图A.空白血；B.空白血加入CsA 对照品；C.样品Fig 2 The HPLC chromatograms of CsA in ratsA.blank blood；B.blank blood and CsA；C.sample

（3）标准曲线的制备：精密称取CsA 对照品10.0mg，置10mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成质量浓度为1.00 mg·mL－1储备液，待用。精密吸取CsA 对照品储备液200μL 于EP 管中，加入1 800μL经预处理的空白全血，配制成质量浓度为100μg·mL－1的全血样品溶液。取上述样品溶液1 000μL于EP管中，加入1 000μL空白全血，依次稀释，配制成质量浓度为100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.562 5，0.781 3，0.390 6，0.195 3，0.097 7，0.048 8，0.024 4μg·mL－1对照品系列溶液。分别进样20μL，以待测物浓度（C）为横坐标，待测物的峰面积（A）为纵坐标，进行回归计算，得CsA 的 标 准 曲 线 为：C ＝43 376 A ＋25 001，r＝0.999 5，线性范围为：0.024 4～100μg·mL－1。

（4）精密度及稳定性试验：用空白全血配制低（0.2μg·mL－1）、中（1.5μg·mL－1）、高（12.5μg·mL－1）3个质量浓度血样各5份，按“2.3”项下方法处理并进样，于一天内进样考察低、中、高3个浓度的日内精密度，连续5d重复考察日间精密度。日内RSD 分别为2.06%，1.57%，1.31%；日间RSD分别为2.68%，2.24%，2.09%；同法于0，6，12，24，36h进样5次，记录色谱峰和峰面积。低、中、高3个浓度血样RSD 分别为2.28%，2.03%和1.87%。结果表明日内和日间精密度、稳定性试验符合方法学要求。

方法回收率试验：用空白全血配制低（0.2μg·mL－1）、中（1.5μg·mL－1）、高（12.5μg·mL－1）3个质量浓度血样各5份，按“2.3”项下方法处理并进样，计算出方法回收率及RSD。方法回收率（%）分别为（95.4±1.3），（97.1±0.9）和（98.1±1.0），RSD 分别为1.16%，0.78%，0.84%。结果显示所用分析方法符合方法学要求，可用于CsA 的药动学研究。

2.3.4 血药浓度测定结果 大鼠服用市售Neoral®和自制CsA－SSEDDS后各时间点所测得的峰面积代入标准曲线计算平均经时血药浓度，并绘血药时曲线图，结果见图3。

图3 市售制剂与自制制剂的药－时曲线图—■—市售；—◆—自制Fig 3 Concentration－time curve of Neoral®and CsA－SSEDDS—■—Neoral®；—◆—CsA－SSEDDS

2.3.5 模型拟合及药动学参数的计算 采用药动学DAS 2.1.1软件，对单剂量给药后血药浓度数据进行处理，2种制剂均是以二室模型和权重为1时拟合后与实际曲线最相符。确定体内过程为二室模型，与文献报道［14－15］一致。由DAS求算的各个药动学 参 数 见 表3。经t 检 验，2 种 制 剂 的Cmax、AUC0→24h、tmax、Ka、MRT0→24h等均不具有显著性差异（P＞0.05）。

表3 药动学参数Tab 3 Parameters of pharmacokinetics

2.3.6 相对生物利用度

相对生物利用度计算公式如下：

以血药浓度－时间曲线下面积AUC，计算自制CsA－SSEDDS对市售Neoral®的相对生物利用度，结果为97.14%。统计学分析结果显示，两制剂无显著性差异（P＞0.05），表明2种制剂在体内的吸收速度、吸收程度及消除过程相似。

3 讨论

本文采用球晶技术制备了高分子多孔微球，并利用此多孔微球采用固体载体吸附法制备CsA 固体自微乳，与普通固体载体吸附法相比，不同的是对载体辅料进行了改善，利用球晶技术制备乙基纤维素多孔微球，联合二氧化硅对液体CsA 自微乳吸附固化，不但可以提高载药量，同时改善了普通固体载体吸附法制备固体自微乳的粉体学性能，可满足直接压片或装胶囊的要求。固化过程中，加入二氧化硅再次对CsA 自微乳固化，其目的是继续吸附固化微球表面的液体自微乳，使固化更完全。

由于CsA 在红细胞、粒细胞及淋巴细胞中分布较多，全血浓度可为血浆浓度的2～9倍［16］，因此为了试验的准确性，本文采用全血进行测定，处理过程中加入氢氧化钠能有效的使红细胞破裂。由于全血样品中内源性成分复杂，干扰较多，本文采用乙醚提取，并用正己烷洗除内源脂溶性成分，可将杂质峰与药物峰完全分离。本法准确、可靠、杂质干扰较少，可满足生物样品分析的要求，适用于体内药物浓度的测定及药动学研究。

实验中，CsA 液体自微乳的制备处方并未做筛选，同Neoral®制备处方一致，初步药动学试验结果显示，Neoral®及自制CsA－SSEDDS平均药时曲线、药动学参数等均相似，其对Neoral®的相对生物利用度为97.14%，差异无显著性，2 种制剂在体内的吸收速度、吸收程度及消除过程相似。初步说明球晶造粒技术可用于制备CsA 固体自微乳，且制得的固体自微乳粉体学性质较好，后续处理简单。

文中并未利用球晶技术直接固化自微乳，目前，作者所在课题组正在致力于此项研究，相信在更多药学工作者的共同努力下，球晶技术制备固体自微乳将会发挥更大作用。

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