淀粉球晶的制备及其理化性质

谢芳，杨银洲，张斌,2，王志刚，黄强,2

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）（2.中新国际联合研究院，广东广州 511363）（3.广州市浪奇实业股份有限公司，广东广州 510660）

球晶为一种具有一定径向对称性的半结晶体，具有双折射现象，其在偏振光下呈“马耳他十字”状[1]。淀粉球晶由淀粉降解后通过重结晶而制备的[1～3]，目前制备淀粉球晶的常用方法为酸解法与酶解法。酸解法主要分为两步：一是快速的酸解淀粉无定型区，由于无定形区的结构疏松，在氢离子的作用下，脱水葡萄糖的构象发生改变，由椅式转变成船式，进而破坏淀粉糖苷键；二是缓慢酸解淀粉结晶区，该区域结构紧实，氢离子不易渗透，因而结晶区的酸解过程需依靠溶剂作用，作用于外部糖苷键的同时，由表及内逐层水解[4,5]。目前主要利用HCl和H2SO4水解淀粉来制备短直链淀粉球晶[6]。酸解法用时较长，回收率较低。刘延奇等[7]利用盐酸水解玉米淀粉35 d，所制A-型淀粉球晶回收率仅为28.2%。酶解法是用脱支酶水解淀粉，异淀粉酶和普鲁兰酶是最常用的两种脱支酶[8]，作用位点为α-1,6键，异淀粉酶能专一水解支链淀粉中的α-1,6键，酶解产生α-构型的短直链淀粉[9]。酶解法制备淀粉球晶的理化性质由淀粉的分子大小和浓度、加酶量、冷却速率和结晶时间等多种因素决定。Cai等[10]以蜡质玉米淀粉和蜡质马铃薯淀粉为原料，利用异淀粉酶在不同的溶液浓度，结晶时间和链长分布条件下制备出A型和B型的淀粉球晶，证实可以通过控制酶解及重结晶条件设计生产不同结晶类型和消化特性的淀粉球晶。

淀粉球晶具有一些独特的功能和特点，可作为稳定剂、增稠剂和保型剂等广泛用于食品、医药和化妆品等领域[11,12]。在维持食品品质的同时可防止食品中油脂的氧化[12]；与原淀粉相比，淀粉球晶中含有较多的慢消化或抗消化淀粉，Kiatponglarp等[13]证实由蜡质米淀粉和普通米淀粉制备的淀粉球晶都具有抗酶解的能力，且蜡质米淀粉所得球晶的抗酶解效果更佳，这种抗消化的特性有利于餐后血糖的控制与肠道健康。

本文探究了蜡质玉米淀粉制备淀粉球晶的工艺条件，采用酶法制备淀粉球晶，考察不同加酶量和结晶时间对淀粉球晶的颗粒形貌、结晶度及热力学性质的影响，为淀粉球晶的制备与应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

试验材料：蜡质玉米淀粉，食品级，购于德州大成食品有限公司。

试验试剂：异淀粉酶（1000 U/mL）：爱尔兰Megazyme公司；醋酸钠、冰醋酸：（分析纯），国药集团化学试剂有限公司，

1.2 仪器与设备

pH 计（SevenEasy），梅特勒-托利多有限公司；集热式恒温磁力搅拌器（DF-101S），巩义市予华仪器有限责任公司；耐压瓶（100 mL），上海精密科学仪器有限公司；核磁共振仪（HD 600），德国Bruker公司；体积排阻色谱（Agilent1200），岛津分析检测仪器有限公司；高速离心机（5180R），艾本德生物技术有限公司；冷冻干燥机（SCIENTZ-18N），宁波新芝冻干设备股份有限公司；激光粒度仪（MS2000），英国Malvern仪器有限公司；扫描电子显微镜（EVO 18），德国Carl Zeiss公司；X射线衍射仪（D8 ADVANCE），德国Bruker公司；差式扫描量热仪（DSC8000），美国PE公司。

1.3 试验方法

1.3.1 淀粉球晶的制备

将淀粉与 0.01 mol/L的醋酸钠缓冲溶液（pH=4.0±0.1）混合配制成质量分数为15%的淀粉乳[10,14]，均分为5份，分别放置于耐压瓶中，密封沸水浴加热1 h，后于120 ℃中油浴30 min使其充分糊化，冷却至50 ℃，分别加入5 U/g、10 U/g、15 U/g、20 U/g和25 U/g异淀粉酶进行酶解，反应24 h后，于140 ℃下加热20 min灭酶，后冷却至25 ℃，保持缓慢搅拌（转速20 r/min）分别在结晶0.5 h、2 h、4 h、8 h、16 h和24 h时取样，5000 r/min离心、水洗，重复三次，冷冻干燥，得淀粉球晶。

1.3.2 链长分布的测定

链长分布通过荧光毛细管辅助糖电泳法（FACE）检测获得，其测定方法参照Wu等[15]。

1.3.3 淀粉球晶分支程度的测定

称取5 mg淀粉样品于核磁管中，加入0.5 mL氘代二甲基亚砜，在 80 ℃水浴锅中充分溶解。核磁检测条件：检测温度为70 ℃，核磁频率为600.17 MHz，探针为PABBO（脉冲880 μS 90°，扫描次数128次，重复时间15.98 s。分支度的计算方法如式1-1所示。

其中：Iα-1,4和Iα-1,6分别代表淀粉分子中α-1,4键（大约5.11×10-6）和α-1,6键（大约4.75×10-6）在核磁共振图谱中所代表峰的积分面积。

1.3.4 回收率

将不同结晶时间下获得淀粉球晶称重，所得淀粉球晶的干基质量M2与所用蜡质玉米原淀粉干基质量M1之比[16]，如式1-2所示。

1.3.5 淀粉球晶的扫描电镜观察（SEM）

淀粉球晶样品于105 ℃下干燥3 h，用导电双面胶将处理好的样品固定在样品台上，置于离子溅射仪中喷金，在扫描电镜下观察淀粉球晶样品，选择具有代表性的样品，分别放大1000倍和5000倍进行拍摄[17]。

1.3.6 淀粉球晶的结晶结构测定（XRD）

测定之前将淀粉样品置于湿度为 100%的干燥器中，平衡24 h；测定条件：Cu-Ka射线，40 kV电压，40 mA电流，起始角和终止角分别为4°和35°，扫描步长0.04°，速度38.4 s/步。样品的相对结晶度由MdI Jade 6.5软件测出。

1.3.7 淀粉球晶的热力学性质分析（DSC）

测定方法参考Cai等[16]。将浓度为30%淀粉样品密封于 DSC盘中，平衡过夜，以空盘作为参照，从30 ℃加热至150 ℃，加热速率为10 ℃/min，通过Pyris软件分析淀粉球晶的起糊温度（To）、峰值温度（Tp）、终止温度（Tc）和焓值（△H），并记录结果。

1.3.8 数据处理和统计分析

各组实验数据重复3次测定，采用Origin 9.0进行数据处理和绘图，采用SPSS 19.0软件进行方差分析对实验数据进行检验。

2 结果与讨论

2.1 蜡质玉米淀粉和淀粉球晶链长分布及其分支度

为了探究蜡质玉米淀粉及其淀粉球晶的侧链链长分布，通过荧光毛细管辅助糖电泳法（FACE）对其分析表征。表1是蜡质玉米淀粉及其所制淀粉球晶的链长分布表，由表 1可知，蜡质玉米淀粉侧链长 6～13和14～24的比例较淀粉球晶的高，而在链长25～36及大于37的比例较淀粉球晶的低；蜡质玉米淀粉的平均链长小于淀粉球晶链长，原因是长链的直链淀粉容易结晶沉淀析出，而分子量较小、链长较短的直链淀粉（小于10）不能形成双螺旋结构参与到晶体的形成，在制备过程中被洗涤弃去[18]，淀粉球晶的链长分布峰值后移，这表明形成淀粉球晶的直链淀粉链长基本在10以上。Cai等[16]研究表明，脱支蜡质小麦淀粉、蜡质玉米淀粉和蜡质马铃薯淀粉的平均链长分别为21.8，24.1和32.1，而重结晶得到的短直链直链淀粉的平均粒径分比为28.1，29.2和35.5，且相较于未处理的淀粉，重结晶后的样品也出现链长分布峰后移的现象，与本文的结果一致。

表1 蜡质玉米淀粉（WM）和淀粉球晶（SCAS）的链长分布Table 1 The distribution of waxy maize starch (WM) and the short chain amylose spherulites (SCAS)

图1 淀粉球晶的核磁共振氢谱图Fig.1 1H NMR spectra of starch spherulites

根据核磁共振氢谱中α-1,6 键（4.7×10-6～5.0×10-6）和α-1,4 键（5.1×10-6～5.4×10-6）化学位移处的峰面积大小来计算[19]，当位于 4.7×10-6～5.0×10-6的α-1,6 键峰面积积分为0时，表明蜡质淀粉已完全脱支。图1为蜡质玉米淀粉和淀粉球晶的核磁共振氢谱图。蜡质玉米淀粉的分支度为 5.8%，随着加酶量的增加（5～25 U/g），α-1,6键的峰面积减小，直至峰面积为0；淀粉的分支度从加酶量5 U/g的2.07%降为25 U/g的0%，表明在加酶量为25 U/g时，蜡质玉米淀粉基本上被完全脱支。许晶晶等[20]证实1%的支链淀粉溶液中加入5 μL异淀粉酶（173 U/g）作用2 h后可完全水解，通过核磁共振氢谱图谱显示，异淀粉酶可在一定条件下将玉米支链淀粉的α-1,6糖苷键水解，对α-1,4糖苷键无水解作用，完全水解支链淀粉可生成具有α或β型还原末端的直链淀粉链或麦芽寡糖，且产物的聚合度（DP）主要在15～35之间。

2.2 结晶时间对淀粉球晶性质的影响

2.2.1 回收率

图2 回收率与结晶时间的关系Fig.2 Relationship between the yield of starch spherulites and crystallization time

图2为结晶时间对回收率的影响，由图2可以看出，随着结晶时间的延长，回收率由结晶时间为0.5 h的56.85%提高至24 h的76.58%，且回收率在结晶16 h后趋于稳定。这是因为淀粉球晶的形成需要一个过程，直链淀粉先形成双螺旋结构，再成核，后堆积长大，在结晶时间较短时（0.5～4 h），一部分直链淀粉还未参与到淀粉球晶的形成，在洗涤的过程中被弃去；而随着结晶时间的继续增加（8 h后），绝大部分直链淀粉已经结晶沉淀，只有一小部分聚合度小于10的短链，不能形成双螺旋结构，也无法参与到直链淀粉球晶的形成，在结晶过程中损失。与酸解法相比，本研究的回收率远高于酸法制备淀粉纳米晶回收率（15.7%，W/W）[21]。此外，Cai等[10]报道酶解法脱支的蜡质淀粉在25 ℃结晶下淀粉球晶的回收率为72%。

2.2.2 淀粉球晶的形貌

图3 不同结晶时间下的淀粉球晶扫描电镜图Fig.3 SEM of starch spherulites at different crystallization time

不同结晶时间淀粉球晶的扫描电镜图如3所示。从图3可以看出，结晶时间为0.5 h所形成的淀粉球晶轮廓边界不清晰，容易堆积成体积较大的颗粒，当结晶时间大于8 h，淀粉球晶的轮廓清晰，单个颗粒的粒径在800 nm左右，但容易聚集在一起形成较大的颗粒。造成此现象的可能原因为：一是淀粉球晶粒较小，颗粒表面的范德华力和静电引力较大，易团聚；二是直链淀粉在堆积的过程中，有交叉现象。Kiatponglarp等[13]通过酶解蜡质米淀粉和米淀粉，然后重结晶制得的淀粉球晶平均粒径大小分别为 7.9±2.1 μm and 14.6±3.7 μm，SEM显示，球晶会聚集形成球粒。Rajesh等[22]采用直链淀粉-棕榈酸复合物制备淀粉球晶，由光学显微镜、热台显微镜、SEM和透射电镜等手段观察，发现所制的球晶有球状、“雪球状”和环面/圆盘状，球晶之间也出现粘连的现象。Cai等[10]制备的淀粉球晶出现聚集，且球粒表面未显示出淀粉球晶清晰的轮廓。

2.2.3 淀粉球晶的结晶结构

短链直链淀粉通过三个步骤形成球晶：（1）淀粉链结合成双螺旋并形成簇；（2）结晶单元重排成纳米颗粒；（3）颗粒生长成为聚集体[16,23]。

图4 蜡质玉米淀粉和淀粉球晶X射线衍射图Fig.4 The X-ray diffraction patterns of waxy maize starch and starch spherulites

图4为淀粉球晶的X射线衍射图，从图4可以看出，蜡质玉米淀粉为A型结晶淀粉，而淀粉球晶为B型结晶，淀粉球晶的晶体类型和结晶温度有很大的关系，有文献报道当结晶温度为4 ℃或25 ℃时，短直链淀粉晶体为B型，50 ℃时为A型晶体[16]，本研究结果与文献报道一致，随着结晶时间的增加，其结晶度由原淀粉的 37.0%增加至结晶 24 h的 51.1%，与Wang等[23]的研究结论相一致。这表明随着结晶时间的增加，其结晶度有增加趋势，在结晶16 h后趋于平缓。白霞[24]研究发现淀粉球晶在室温下初始结晶度随着时间的延长而增大，而在结晶1 d后结晶度不再变化。结晶度的增加，间接反映出组成淀粉球晶的直链淀粉排列有序性的提高，形成的球晶结构紧密。

2.2.4 淀粉球晶的热力学性质

不同结晶时间下淀粉球晶热力学性质如表 2所示。由表2可以看出，淀粉球晶的起糊温度（To）、峰值温度（Tp）、终止温度（Tc）和焓值（△H）显著高于原淀粉，与Cai等[16]的研究结果一致；淀粉球晶的起糊温度随结晶时间的增加而升高，结晶24 h后淀粉球晶的起糊温度、峰值温度、终止温度和焓值分别达到75.09 ℃、90.96 ℃、107.03 ℃和17.44 ℃。表明形成的淀粉球晶相对于蜡质玉米淀粉结构较为紧密，在较高温度下才能破坏晶体结构；吸热焓值和淀粉结晶度有一定的对应关系[25]，焓值越高，结晶度也相应增加，这和XRD测得结果相吻合，也和Liu等[26]报道的结果一致。

表2 蜡质玉米淀粉和淀粉球晶的热力学性质Table 2 Thermodynamic properties of waxy maize starch and starch spherulites

3 结论

本研究以蜡质玉米淀粉为原料制备淀粉球晶，糊化后加入25 U/g异淀粉酶淀粉可完全脱支；在25 ℃下结晶，随着结晶时间的延长，回收率与结晶度可随着结晶时间的延长而增加，于24 h达到最高，分别为76.58%与51.1%；热力学性质中起糊温度（To）、峰值温度（Tp）、终止温度（Tc）和焓值（△H）则随之的增加而增加；SEM图像表明虽然随着结晶时间的增加淀粉球晶的颗粒形态逐渐清晰，而淀粉颗粒之间存在聚集现象。在最佳用酶量为25 U/g与结晶时间为24 h条件下可高效制备淀粉球晶，为淀粉球晶的工业化生产和应用提供了理论基础。为了利用球晶的颗粒性质，后续要解决酶法制备淀粉球晶团聚现象，从而拓展淀粉球晶应用的领域。