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熄风通脑胶囊的质量控制

2013-12-23曾聪彦梅全喜胡玉良辛晓芳广州中医药大学附属中山中医院广东中山528400

中国医院药学杂志 2013年18期
关键词:钩藤薄层芍药

曾聪彦,梅全喜,胡玉良,辛晓芳 (广州中医药大学附属中山中医院,广东 中山528400)

熄风通脑胶囊由石决明、钩藤、三七、赤芍、珍珠母、蒲黄、豨莶草、牡丹皮、地黄等12味中药组成,为广州中医药大学附属中山中医院常用制剂(制剂批准文号:粤药制字Z20110102)。本制剂具有熄风通脑、祛痰开窍、活血化淤之功,主要用于脑梗死急性期所致的肢体偏瘫、口角歪斜、语方謇涩等。为有效控制该制剂产品质量,保证用药的安全有效,本文按中药新药研究相关技术规范,根据以上几味药的理化性质,采用薄层色谱(TLC)法对制剂中赤芍、钩藤、三七、大黄进行了定性鉴别研究,同时使用高效液相色谱(HPLC)法测定了制剂中芍药苷的含量,建立了可靠、准确、专属性强的质量控制方法。

1 材料

1.1 仪器 Agilent-1100 高效液相色谱仪[美国安捷伦公司,Venusil XBP C18(L)色谱 柱(250 mm×4.6 mm,5μm,Agela Technologies)];CAMAG TLC SCANNERIII型 薄 层扫描仪(瑞士);CAMAG TLC SAMPLER4 型自动点样仪(瑞士);PBQ-Ⅱ型薄层自动铺板器(重庆南岸实验电器厂)。

1.2 试药 赤芍对照药材、三七对照药材、钩藤对照药材、大黄对照药材购自中国食品药品检定研究院(批号分别为121093-200402,120941-200506,121190-200402,902-9902);芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号110736-201136,含量96.0%);乙腈为色谱纯,水为双蒸水,其余试剂均为分析纯;熄风通脑胶囊由广州中医药大学附属中山中医院制剂室生产(批号20120523,20120730,20120918)。

2 定性鉴别

2.1 赤芍的鉴别 取本品内容物2.4 g,加水30 mL,微热使溶解,加水饱和正丁醇萃取2 次,每次30 mL,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇2 mL 使溶解,作为供试品溶液。取缺赤芍药材的其余各药制成的阴性对照品2.4 g,按供试品溶液方法制得赤芍阴性对照溶液。另取赤芍对照药材0.5 g,加乙醇10 mL,超声处理10 min,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇2 mL使溶解,作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液、阴性对照溶液各20μL及对照药材溶液10μL,分别点于同一硅胶G 薄层板上使成条带,以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照色谱无此斑点。见图1。

图1 熄风通脑胶囊中赤芍的薄层色谱图1~3.供试品;4.对照药材;5.阴性对照Fig 1 TLC of Radix Paeoniae Rubra1~3.samples;4.reference substance;5.negative control

2.2 三七的鉴别 取本品内容物3.2 g,加水30 mL,微热使溶解,加水饱和正丁醇萃取2 次,每次30 mL,合并正丁醇液,继用氨试液洗涤2次,每次20 mL,再用正丁醇饱和的水洗涤2次,每次20 mL,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇2 mL 使溶解,作为供试品溶液。取缺三七药材的其余各药制成的阴性对照品3.2 g,按供试品溶液方法制得三七阴性对照溶液。另取三七对照药材1 g,加水饱和的正丁醇30 mL,超声处理20 min,滤过,滤液用氨试液洗涤2次,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典一部附录ⅥB)试验,吸取上述3种溶液各10μL,分别点于同一高效硅胶G 薄层板上,以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性对照色谱无此荧光斑点。见图2。

图2 熄风通脑胶囊中三七的薄层色谱图1~3.供试品;4.对照药材;5.阴性对照Fig 2 TLC of Radix et Rhizoma Notoginseng1~3.samples;4.reference substance;5.negative control

2.3 钩藤的鉴别 取本品内容物4.8 g,加水50 mL,微热使溶解,冷却后,加氯仿-丙酮(1∶1)混合液30 mL,振摇提取,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇1 mL 使溶解,作为供试品溶液。取缺钩藤药材的其余各药制成的阴性对照品4.8 g,按供试品溶液方法制得钩藤阴性对照溶液。另取钩藤对照药材5 g,加水煮提1 h,滤过,滤液浓缩至约30 mL,加氯仿-丙酮(1∶1)混合液30 mL 提取,同供试品溶液的制备方法制成钩藤照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典一部附录ⅥB)试验,吸取上述取供试品溶液、阴性对照溶液各10μL,钩藤对照药材溶液8μL,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G 薄层板上,以氯仿-醋酸乙酯-甲醇(10∶5∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性对照色谱无此荧光斑点。见图3。

图3 熄风通脑胶囊中钩藤的薄层色谱图1~3.供试品;4~5.对照药材;6.阴性对照Fig 3 TLC of Ramulus Uncariae Cum Uncis1~3.samples;4~5.reference substance;5.negative control

2.4 大黄的鉴别 取本品内容物3.2 g,研细,加甲醇30 mL,超声处理15 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水20 mL 使溶解,加盐酸调pH 至2,加乙醚萃取2次,每次20 mL,合并萃取液,蒸干,残渣加甲醇2 mL使溶解,作为供试品溶液。取缺大黄药材的其余各药制成的阴性对照品3.2 g,按供试品溶液方法制得大黄阴性对照溶液。另取大黄对照药材0.5 g,加甲醇30 mL,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典一部附录ⅥB)试验。吸取上述供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL及对照药材溶液5μL,分别点于同一硅胶G 薄层板上,以石油醚(30~60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性对照色谱无此荧光斑点。见图4。

图4 熄风通脑胶囊中大黄的薄层色谱图1~3.供试品;4.对照药材;5.阴性对照Fig 4 TLC of Radix Rheum1~3.samples;4.reference substance;5.negative control

3 芍药苷的含量测定

3.1 色谱条件 色谱柱:Venusil XBP C18(L)柱(250 mm×4.6 mm,5μm,Agela Technologies);流动相为乙腈-0.1%磷酸溶 液(18∶82);检 测 波 长 为230 nm[2];流 速:1.0 mL·min-1;柱温:25 ℃。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液 精密称取芍药苷对照品适量,加甲醇溶解,制成每l mL含50μg的溶液,作为对照品溶液。

3.2.2 供试品溶液 取本品10粒,内容物研细,精密称取约1 g,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,超声处理30 min,放冷,再称定,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液1 mL,置5 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,用0.45μm的微孔滤膜过滤,即得。

3.2.3 阴性对照溶液 按处方比例称取缺赤芍的其余药味,按熄风通脑胶囊制备工艺制备阴性样品,然后按“3.2.2”项下方法操作,制备阴性对照溶液,

3.3 专属性试验 取“3.2.1”,“3.2.2”,“3.2.3”项下的对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各20μL,按“3.1”项下色谱条件进行测定,记录色谱图,结果在与对照品保留时间相同的位置上无色谱峰出现,表明熄风通脑胶囊中其他成分对芍药苷的测定无干扰,见图5。

图5 高效液相色谱图A.芍药苷对照品;B.供试品;C.阴性对照;1-芍药苷Fig 5 HPLC chromatogram A.standard substance;B.sample;C.negative sampLe;1-Paeoniflorin

3.4 线性关系的考察 精密称取芍药苷对照品8.6 mg,加甲醇适量溶解并稀释至20 mL;精密量取上述溶液5 mL,用甲醇稀释至10 mL,摇匀;再精密量取上述溶液5 mL,用甲醇稀释至10 mL,摇匀,按上述方法依次稀释,分别制成质量浓度为0.412 8,0.206 4,0.103 2,0.051 6,0.025 8,0.012 9 mg·mL-1的对照品溶液。每一浓度进样20μL,以峰面积积分值为纵坐标,芍药苷对照品浓度为横坐标。绘制标准曲线,得回归方程:y=13 541x+5.292,r=0.999 9。结果表明芍药苷在0.012 9~0.412 8 mg·mL-1时呈良好的线性关系。

3.5 精密度试验 在上述色谱条件下,精密吸取对照品溶液(质量浓度为50μg·mL-1)20μL注入高效液相色谱仪,重复进样5次,分别测定芍药苷峰面积,RSD 为0.97%,表明仪器精密度良好。

3.6 稳定性试验 取熄风通脑胶囊(批号20120918)按照“3.2.2”项下方法制备供试品溶液,分别于0,1,2,4,8,24 h时分别进行测定,结果芍药苷平均峰面积为493.0,RSD=1.4%(n=6),表明样品溶液放置24 h内稳定。

3.7 重复性试验 取熄风通脑胶囊(批号20120918)样品6份,分别按照“3.2.2”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定峰面积。结果RSD 为0.8%,表明重现性良好。

3.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品(20120918)6份,分别添加芍药苷对照品适量,按样品测定方法制成供试品溶液,依法进行测定,计算回收率,结果见表l。

表l 加样回收率试验结果(n=6)Tab 1 Results of recoveries(n=6)

3.9 样品测定 按“3.2.1”项下和“3.2.2”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液,分别精密吸取20μL,依照“3.1”项下色谱条件测定,3 批样品中芍药苷的含量测定结果见表2。

表2 熄风通脑胶囊中芍药苷的含量测定结果(n=3)Tab2 Content of paeoniflorin in Xifeng Tongnao capsules(n=3)

4 讨论

由于本制剂是由10多味中药组成的复方制剂,成分较为复杂,薄层鉴别过程中对提取方法及展开剂的选择有较高要求。在赤芍、三七、大黄的薄层色谱条件试验过程中,基本都参照中国药典2010年版一部薄层鉴别方法,只在提取溶剂方面作了稍微调整和更改,使结果更稳定,且方法简便易行,斑点分离清晰,阴性对照无干扰。在钩藤的薄层色谱条件试验过程中,也曾参照中国药典2010年版一部钩藤项下薄层鉴别方法,采取了浓氨试液碱化后,直接用氯仿提取,但结果显示供试品色谱色谱图中,在与对照药材色谱相对应的位置上斑点不明显。考虑本制剂钩藤等主要药味均以水煎煮工艺提取,根据有关文献报道方法,钩藤对照药材采用与本制剂提取工艺一致方法,先加水煎煮后再用有机溶剂提取,结果薄层试验效果良好[1]。实验结果表明,熄风通脑胶囊中赤芍、三七、大黄、钩藤采用文中薄层色谱方法进行定性鉴别,色谱特征斑点明显,专属性强,可用于该制剂的定性鉴别。

采用HPLC法测定芍药苷含量时,本文色谱条件曾参照中国药典2010 年版一部中赤芍含量测定项下的色谱条件[2],以甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(40∶60)为流动相,结果样品中芍药苷峰与杂质峰不能有效分离。后参照中国药典2010年版一部中白芍含量测定项下的色谱条件[2],考察了乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)、(25∶75)、(18∶82)流动相体系下熄风通脑胶囊中芍药苷和其他组分的分离情况。最终确定乙腈-0.1%磷酸溶液(18∶82)为最佳流动相系统,各峰分离效果较好,其他成分无干扰。经试验证明本文方法对测定本品中芍药苷含量有效,主要表现为该法重复性好,专属性好,稳定可靠,方便快捷,能准确地控制产品中芍药苷的含量,可作为该制剂的质量控制方法。

[1] 李如敏,焦爱军.安舒力口服液的薄层鉴别研究[J].广西医科大学学报,2002,19(3):385-387.

[2] 中国药典.一部[S].2010:148,97.

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