枯草芽孢杆菌角蛋白酶kerC基因在毕赤酵母中的高效表达

韩学易，唐自钟，王丽华，陈 惠*

(四川农业大学生命科学与理学院，四川 雅安 625014)

角蛋白是一种具有极强抗性难降解的硬蛋白，主要存在于动物的毛发、羽毛及鳞片等组织中，其化学结构稳定，难以被一般的蛋白酶所降解[1-2]，这样极大地阻碍了角蛋白资源的有效利用。角蛋白酶具有降解天然角蛋白的特性，可专一地降解角蛋白[3-4]，使其在食品、医药、饲料和制革等工业中得到广泛应用，并可降解疯牛病和人类克雅氏症的Prion蛋白[5-6]，成为目前研究热点，应用价值巨大。近年来，能够分泌角蛋白酶的菌株被陆续分离鉴定，具有潜在应用价值的基因被陆续克隆表达[7-9]。在角蛋白酶基因的表达研究中，巴斯德毕氏酵母表达系统有胞外分泌型，根据外源蛋白特性选择合适的表达菌株和载体，可以实现外源蛋白的高效表达[10-11]，并且操作简单，表达水平稳定，易于工业化生产。

目前角蛋白酶的研究主要集中在菌种筛选、酶学性质等方面，已经报道的角蛋白酶表达菌株活性相对较低，大规模生产应用未见报道。本实验室前期已筛选出产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌B-3，成功克隆角蛋白酶基因kerC，构建了大肠杆菌表达载体BL21-pET-kerC，实现其在大肠杆菌BL21中的异源表达，但酶活力提高并不明显。本研究将角蛋白酶基因kerC构建于表达载体pPICZαA上，电击转入毕氏酵母X-33，实现其在真核表达系统中的高效表达，以期为进一步角蛋白酶的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33、质粒pET-kerC和克隆载体、pPICZαA 美国Invitrogen公司；pMD19-T Simple Vector 宝生物工程(大连)有限公司。

各种DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA和蛋白质分子质量标准品 宝生物工程(大连)有限公司；Taq DNA聚合酶 天根生化科技有限公司；DNA胶回收试剂盒 上海Omega生物技术有限公司；其他常规试剂均为国产分析纯或进口分装；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

大肠杆菌培养采用LB培养基，转化子筛选用氨苄青霉素抗性和博莱霉素抗性，终质量浓度分别为100、25μg/mL；酵母培养用YPD培养基和BMGY培养基，产酶培养基为BMMY培养基。

1.2 仪器与设备

MyCyclerTM PCR仪、电穿孔仪、GelDoc凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；D-37520高速冷冻离心机 美国Thermo公司；UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；DK-8D电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司。

1.3 角蛋白酶基因kerC片段的扩增

由角蛋白酶基因kerC序列，设计PCR扩增特异引物，Up：5'-CCGGAATTCGCCGGAAAAAGCAGTACAGA-3’，下划线为EcoRⅠ酶切位点，Down：5’-AGGTCTAGATT ATTGTGCAGCTGCTTGTAC-3’，下划线为XbalⅠ酶切位点。

1.4 角蛋白酶基因kerC重组表达载体的构建

利用XbalⅠ和EcoRⅠ双酶切得到的kerC基因片段，连接到经相同双酶切处理的表达载体pPICZαA，得到重组表达质粒，线性化后电击转化毕赤酵母X-33，挑取Zeocin抗性筛选得到的阳性转化子，扩大培养，提取总DNA，并以总DNA为模板，用通用引物进行PCR筛选鉴定阳性转化子。

1.5 重组角蛋白酶的SDS-PAGE分析

将重组菌株接种于BMGY培养基，于30℃、200r/min振荡培养24h后作为种子液接入BMMY诱导培养基，每隔24h添加甲醇使甲醇的终体积分数为1%，108h后离心收集上清即为粗酶液。将粗酶液透析浓缩后，用DEAE纤维素阴离子柱纯化，收集有酶活力的洗脱峰，经透析浓缩后作为SDS-PAGE上样液。电泳时制备12%的分离胶和5%的浓缩胶进行，同时点上粗酶液和空质粒对照组进行SDS-PAGE分析。

1.6 重组角蛋白酶活力测定

参考Vermelho等[12]方法，并作改进：取1mL发酵液上清，加入2mL Tris-HCl缓冲液配制的羽毛粉底物，于50℃恒温振荡水浴锅中反应1h，加入2mL 20%三氯乙酸(TCA)终止反应，4℃、10000r/min离心5min，在波长280nm处测定上清液吸光度。以灭活酶液作为对照。酶活力单位(U)定义：在以上反应条件下，吸光度每增加0.10为1U。

1.7 重组菌株产酶条件优化

1.7.1 甲醇诱导体积分数对产酶的影响

将角蛋白酶重组菌接种到不同甲醇体积分数(0.5%、0.7%、1.0%、1.5%、2.0%)的BMMY诱导培养基中，每隔24h加入甲醇使其达到相应体积分数， 108h后取上清液测其酶活力。

1.7.2 诱导时间对产酶的影响

将角蛋白酶重组菌接种到BMMY诱导培养基，按1.0%甲醇进行诱导培养，分别在不同时间(72、84、96、108、120、132h)收集上清测定酶活力。

1.8 重组角蛋白酶的酶学性质分析

1.8.1 重组角蛋白酶作用的最适温度和热稳定性

分别在不同温度(30、40、50、55、60、65、70、80℃)条件下测定重组角蛋白酶活力，并在以上温度条件下将重组角蛋白酶保温30min后于50℃反应1h测定剩余酶活力分析其热稳定性。

1.8.2 重组角蛋白酶作用的最适pH值和pH值稳定性

在不同pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0)条件下分析重组角蛋白酶活力变化，将该酶分别在以上pH值环境条件下保温30min后测定酶活力分析其pH值稳定性。

1.8.3 金属离子对重组角蛋白酶作用的影响

在含有3mmol/L不同金属离子的环境中，测定重组角蛋白酶的酶活力，以未加金属离子的酶活力为100%。

2 结果与分析

2.1 角蛋白酶基因的克隆及表达载体的构建

以质粒pET-kerC为模板，高保真酶扩增kerC基因序列，将其连接T载体后，转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR筛选阳性转化子。将质粒pPICZαA与T-kerC同时进行XbalⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收、连接，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR和酶切鉴定结果。如图1表明，kerC基因成功连接到表达载体pPICZαA，命名为pPICZαAkerC。将重组表达载体线性化后，电转毕赤酵母X-33，经含Zeocin抗性的YPD平板筛选，以总DNA为模板，用通用引物进行PCR扩增后，经1%琼脂糖凝胶电泳分析其条带大小为1000bp左右即为阳性转化子。电泳结果表明表达载体pPICZαA-kerC成功转入到毕赤酵母X-33中。

图 1 菌落PCR鉴定(A)和表达载体pPICZαA-kerC的酶切分析(B)Fig.1 PCR identification of colonies (A) and restriction enzyme analysis of plasmid pPICZαA-kerC (B)

2.2 角蛋白酶基因的诱导表达

2.2.1 甲醇诱导体积分数对产酶的影响

图 2 不同体积分数甲醇诱导下角蛋白酶的活性Fig.2 Effect of methanol concentration on keratinase activity

由图2可知，当甲醇诱导体积分数为1%时酶活力达到最大，甲醇体积分数超过1%时，随着甲醇体积分数的升高，酶活力迅速下降。因此，重组酶最佳甲醇诱导体积分数为1%。

2.2.2 诱导时间对产酶的影响

图 3 不同时间诱导下角蛋白酶的活性Fig.3 Effect of induction time on keratinase activity

由图3可知，随着诱导时间的延长，角蛋白酶活力不断升高。当诱导培养时间达到108h时，酶活力达到最大，其后随着时间的延长，酶活力逐渐降低，108h为重组酶产酶最佳诱导时间。

图 4 重组角蛋白酶的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant keratinase

2.2.3 SDS-PAGE分析经DEAE-纤维素柱层析纯化后的重组角蛋白酶进行SDS-PAGE分析。由图4可知，重组酶分子质量约31kD，与经ExPASy Proteomics Server软件对重组角蛋白酶的氨基酸序列进行分子质量预测值接近(36.1kD)。

2.3 重组角蛋白酶的性质分析

2.3.1 重组角蛋白酶作用的最适温度和热稳定性

图 5 温度对重组角蛋白酶活力的影响Fig.5 Effect of temperature on activity of the recombinant keratinase

图 6 重组角蛋白酶的热稳定性Fig.6 Temperature stability of the recombinant keratinase

由图5可知，在不同温度条件下测定重组角蛋白酶酶活力，结果表明其最适反应温度为60℃。将重组角蛋白酶保温30min后测定剩余酶活力，由图6可知，重组角蛋白酶在30～65℃范围内具有较高的热稳定性，高于65℃时酶活力开始下降，但在80℃时仍能达到最高酶活力的50%。

2.3.2 重组角蛋白酶作用的最适pH值和pH值稳定性

图 7 不同pH值条件下重组角蛋白酶的酶活力Fig.7 Effect of pH on activity of the recombinant keratinase

图 8 重组角蛋白酶的pH值稳定性 Fig.8 pH stability of the recombinant keratinase

由图7可知，重组角蛋白酶最适反应pH值为7.5。由图8可知，重组角蛋白酶在pH7.0～8.5的范围内比较稳定，高于pH8.5，酶迅速失活。

2.3.3 金属离子对重组角蛋白酶活力的影响

表 1 不同金属离子对重组角蛋白酶活力的作用Table 1 Effect of different metal ions on activity of the recombinant keratinase

在含有不同金属离子的环境中，测定重组角蛋白酶的酶活力，由表1可知，Ca2+、Co2+和Fe2+均可提高角蛋白酶的活力，在3mmol/L离子浓度反应条件下，酶活力分别提高0.31倍、1.89倍和12.64倍。Na+、Zn2+、Mn2+、K+、Cu2+和Mg2+对重组角蛋白酶活力有不同程度的抑制作用，而Fe3+完全抑制其酶活力。

3 讨 论

目前，已有很多能产角蛋白酶的微生物被报道，角蛋白酶基因相继被克隆，并且实现了异源表达，但表达量不高，酶活力相对较低。Lin等[13]将角蛋白酶kerA基因转入B.subtilis菌株DB104中，转化子FDB-29的角蛋白酶产量仅提高了3～5倍；Porres等[7]将Bacillus licheniformis PWD-1的kerA基因克隆到pPICZαA和pGAPZαA载体上，转化毕赤酵母X-33，转化子经甲醇诱导，144h后产酶量为124mg/L；季金殿等[14]克隆了嗜麦芽窄食单胞茵S. maltophilia YHJ-1基因kerD，实现了在大肠杆菌中的表达，酶活力为10.5U/mL。本研究从枯草芽孢杆菌B-3中克隆得到角蛋白酶基因kerC，构建了重组表达载体pPICZαA-kerC，转化巴斯德毕赤酵母X-33，重组菌株以1%体积分数的甲醇诱导培养108h后，酶活力达到32.31U/mL，是原核表达菌株BL21-pET-kerC的11.15倍，表达效果优于前述报道，成功实现了角蛋白酶的异源高效表达，为角蛋白酶的工业化生产奠定基础及提供依据。

已报道的角蛋白酶分子质量在16～440kD[15]范围，大多数是30kD左右，最适pH值是pH7.5～l0.0，最适温度范围在30～75℃，多数在45～55℃[15]，不同来源的角蛋白酶酶学性质有一定差异。赖欣等[16]报道的角蛋白酶最适反应温度和最适反应pH值分别为55℃和7.0，pH5.5～8.0时酶活力较稳定，可达最大酶活力的70%以上；邹晓凤等[17]研究的角蛋白酶kerF分子质量为50kD，最适作用pH值和最适作用温度分别为pH9.0和50℃；Radha等[18]报道的角蛋白酶分子质量大小分别为30kD和39kD，最适作用pH值和最适作用温度分别为8.0和70℃；Cao Zhangjun等[19]纯化得到的角蛋白酶分子质量约为35.2kD，最适作用pH值和最适作用温度分别为7.8和40℃。本研究重组角蛋白酶kerC分子质量约为31kD，最适反应温度和最适反应pH值分别为60℃和7.5，在30～65℃范围内具有较高的热稳定性，80℃保温30min后剩余酶活力仍达到最高酶活力的50%；在pH7.0～8.0范围内能保持最高酶活力的80%以上，中性和弱碱性的条件下具有较好的pH值稳定性。

微量金属离子在一定程度上能增强或抑制角蛋白酶的酶活力。Li Jiang等[20]报道在1mmol/L Cu2+环境中，角蛋白酶sfp2活力增强49.4%，在1mmol/L Co2+、Fe2+和Ca2+环境中，酶活力受到一定程度的抑制。Lü Longxian等[21]报道1mmol/L的Co2+、Zn2+能增强Chryseobacterium L99角蛋白酶活力，但Ca2+、Fe3+对其活力有抑制作用。Balaji等[22]报道5mmol/L的Mn2+、Ca2+、Zn2+能显著提高Bacillus subtilis MTCC(9102)角蛋白酶活力，但酶活力受到5mmol/L的Cu2+抑制。可见，相同的金属离子作用不同来源的角蛋白酶，其结果存在差异。在本研究中，在3mmol/L离子环境中，Ca2+、Co2+和Fe2+可以增强重组角蛋白酶活力，而Fe3+却完全抑制重组角蛋白酶活力，Na+、Zn2+、Mn2+、K+、Cu2+和Mg2+能在不同程度上抑制其酶活力。

本研究成功实现了枯草芽孢杆菌角蛋白酶基因的高效表达，为该基因的进一步研究和应用奠定了良好的基础，实验室期望通过进一步完善发酵和分离纯化工艺，以及采用高密度发酵培养等技术，以最大化提高角蛋白酶的产量和活性，使其能最终应用于工业化生产。

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