根特异性启动子的种类和功能

王春燕 王孝坤 李巧玲 谢成建 杨星勇

（重庆师范大学生命科学学院，重庆 401331）

植物根系统是固定植物的根基，是植物吸收水分、无机盐等的唯一通路，也是合成和贮藏营养物质的重要器官，在植物生命过程中发挥着举足轻重的作用［1］。根是植物重要的营养器官，针对植物根特异性表达基因的启动子的研究，为使外源蛋白在植物根中特异表达成为可能［2］。在植物基因工程应用中，根特异性启动子广泛应用于抗病基因等在植物根中的特异表达，提高植物抵抗土壤致病菌的侵害能力［3］；耐盐碱分子机制研究，提高植物对恶劣环境的适应度［4］；甚至改进植物代谢途径，提高根中营养物质的含量［5］。因此，植物根特异性启动子的研究对植物基因工程的发展和人类生活水平的提高具有十分重要的意义。

1 源于植物根组织的特异启动子

植物地下部分所有根的总体称为根系，双子叶植物根系大多是直根系，单子叶植物的根系大多是须根系。植物根的结构主要由根冠、分生区、伸长区和根毛区组成。根组织特异表达基因是根特异性表达启动子的主要来源。依据植物根的不同组成部位以及表达基因的不同，可以将植物根组织启动子分成5类。

1.1 根毛特异启动子

根毛的形态发生直接决定于根部根毛细胞（生毛细胞或者H细胞）基因的特异性表达［6，7］。拟南芥棒曲霉素A7基因（At EXPA7、表1序号1）和棒曲霉素A18基因（At EXPA18、表1序号2）是维管植物根组织中普遍存在的一类基因，都包含保守的根毛特异表达元件（RHES），在根毛形态发生过程中特异性表达，协助根毛的发生生长［8］。拟南芥棒曲霉素基因时空特异性表达必需的顺式调控元件位于转录起始位点上游，在不同根毛类型植株中位置略有不同。在以拟南芥为代表的三型根毛（type 3 root hairs）以及以水稻为代表的二型根毛（type 2 root hairs）中，该元件通常以多拷贝形式存在，在棒曲霉素同源基因中，此元件也普遍存在，并且直接影响到启动子的活性［8-10］。

表1 用于转基因研究中的根特异性启动子

植物根毛的形成，包含根毛凸起的形成和尖端的生长；在这个过程中，伴随着细胞壁的修整、组装和装配。在根毛形成的细胞壁动力学过程中，棒曲霉素参与细胞壁的解离，纤维素合成酶参与细胞壁的组装，而富含亮氨酸的蛋白以及富含脯氨酸的蛋白则完成细胞壁的装配［11］。纤维素合成酶基因（At CSLD3、表1序号3）在根毛细胞特异性表达，包含两个RHES调控元件［10］，在富含亮氨酸蛋白和富含脯氨酸蛋白基因中也是同样的情况［12］。此外，Won等［13］研究发现，编码细胞壁解离蛋白的基因EXPANSIN A（EXPA，表1序号4）和EXP B（表1序号5）启动子中根毛特异表达元件（RHES）也发挥着重要的作用；在禾本科植物中，水稻和大麦的同源EXP B基因的启动子的近侧区域都包含RHES元件，这些启动子可以指导GFP在根毛的特异性表达；启动子分段缺失分析显示RHES元件对于指导基因定位于根毛特异性表达是必须的。

在这些根毛特异性基因启动子中，启动子为根毛特异性顺式元件所调控，同时也对激素和环境刺激作出应答反应［14］，根毛的发生和延长依赖钙离子的存在［15，16］，而且光照与否也能够对根毛特异性基因的表达起到调控作用［9］。目前对棒曲霉素A7基因以及其同源基因已经有了清晰的了解，它的启动功能和应用潜力在发掘之中。

1.2 根冠基因特异启动子

植物根冠由薄壁细胞组成，根冠区的细胞寿命短、易脱落，细胞内的高尔基体分泌大量黏液（主要是多糖），在根冠表面形成黏胶层，即为根分泌物，也称为根际［17］。豌豆果胶酯酶基因（rcpme1、表1序号6）是根冠分泌物编码基因之一，将rcpme1基因作为根分泌物表达的标志，其启动子与苯甲氨酸解氨酶（PAL）和根瘤素基因启动子同源，可以引导gus基因于根冠高水平表达［1］。rcpme1基因启动子具有十分严格的时空调节能力，侧翼序列约2.75 kb包含了多种特异性顺式作用元件。两个AC丰富序列CCAAACACCATCCAA和CCAACCACAACA位于-561到-547区及-721到-709区，这两个序列与维管植物苯甲氨酸解氨酶（PAL、表1序号7）基因的启动子高度同源，与根瘤素启动子的同源序列AAAGT和CTCTT出现在4区和11区。此外，TATA盒位于-23到-28区、两个G盒位于-1 073区、一个I盒位于-58区，这些顺式作用元件广泛分布于rcpme1基因启动子中，与该启动子的根冠特异性表达活性密切相关［1］。

根际通过调整根周围生态结构，对植物的健康生长及产量产生重大影响，鉴定根分泌模式是对根际环境研究的重要突破点［18，19］。rcpme1基因是根尖边缘细胞与根冠分离过程中的关键基因，该基因定位于植物的根尖，并且伴随着其他根冠分泌物的表达。因此，在已有研究中，将rcpme1基因作为根冠分泌物的分子标记，以此对根冠分泌过程中的不同影响因素的作用效果进行定量分析［20，21］。

近10年来，“根际”这一特殊区域成为研究的热点，根系分泌物与根际微生物间相生相克关系的研究是其中的一个重要方向［22-26］。Elena等［27］研究发现，根冠特异性基因AtCel5（表1序号8）表达产物是β-1，4-葡聚糖酶，在根穿透土壤的过程中，协助根冠周边细胞脱落。AtCel5启动子能携带gus基因在根冠细胞和根冠脱落的细胞中特异性表达。因此，AtCel5启动子可以作为分析根冠细胞生理过程的分子标记，也是研究根冠与环境有益因子相互作用的有力工具。

根冠不仅是根分泌物表达并发挥效能的组织区域，更是植物抵御食根性病虫害的重要组织［28］。Catherine等［29］利 用MDK4-20（表1序 号9）启动子在拟南芥和马铃薯等植物中表达线虫干扰肽，MDK4-20启动子启动gus基因在根冠细胞中特异性表达，其引导的线虫干扰肽表达水平与组成型启动子CaMV35S相比较要高出2倍左右。在MDK4-20启动子以及其同源启动子中存在ATATTTAT元件，包含了根特异顺式作用元件ATATT。根冠表达特异启动子可以用来驱动植物抗肽基因在植物根部特异性的表达，针对性的提高了植物对土壤中的病虫害的抵御能力［30］。

1.3 液泡胞液蛋白基因启动子

烟草根特异性表达基因TobRB7（表1序号11）是发现较早的根特异性启动子之一，编码液泡胞液蛋白，该基因在根分生组织以及根部未成熟区的中心柱区域特异性表达［31］。TobRB7基因启动子在植物基因工程中应用广泛。在植物病害研究中，利用转基因植物特异性表达靶定植物病原物特异基因的dsRNA发夹结构；当病原物通过根部侵染时，将完成对病原特定基因的沉默效应，从而达到对病原体的防治［32］。此外，作为根特异表达的启动子，TobRB7基因启动子的应用主要集中在植物根部特异表达基因，研究信号分子在细胞间传递方式等［33］。虽然TobRB7启动子是根部特异表达的理想启动子，但在启动效果上没有CaMV35S启动子强［34］。

TobRB7基因有诸多同源基因，如FaRB7基因（表1序号10），该基因表达产物是草莓液泡膜嵌入蛋白，在根部特异性表达，在叶柄处有微弱表达。FaRB7基因启动子中的根特异性调控元件与烟草TobRB7启动子的同源［31］，FaRB7启动子在草莓中表现为近根表达，在异源宿主中则表现为组成型表达（如烟草），可作为组成型启动子CaMV35S的替代［35］。FaRB7基因分析表明，该基因在根中与水的吸收和运输密切相关，该基因协助维管组织水运输的完成，因此表现为近根表达［35］。其他液泡胞液蛋白RB7-type TIP的同源基因还有很多，如松叶菊的水通道蛋白基因、向日葵根部的水通道嵌入蛋白基因等［36，37］，这些基因的启动子在植物根特异性表达研究中都有着诸多应用。

1.4 根特异性糖基转移酶基因启动子

根特异性糖基转移酶基因Atlg73160（表1序号12）的启动子是从拟南芥中发现提取的，该基因编码一个根特异性表达的糖基转移酶，其启动子可以引导报告基因gus基因在根部全根高效表达［38］。对Atlg73160启动子序列分析发现，有大量根特异性调控元件位于启动子上游，如ASF1 MOTIF CAMV、ARFAT、OSE1、OSE2、RAV1AAT、SURE core和TAPOX1等［38］。在半枝莲Atlg73160基因研究中发现，这些调控元件也参与根特异表达调控过程［39］。Atlg73160基因是糖基转移酶基因中特异定位于根部表达的基因，可以应用于根部对营养物质摄取的提高，以及植物耐受性方面的应用［38］。

1.5 根特异性磷酸盐转运蛋白基因启动子

磷酸盐转运蛋白基因MtPT1和MtPT2（表1序号13、14）发现于蒺藜苜蓿根部，其启动子可以引导报告基因gus和gfp在拟南芥等植物根部特异性表达［40］。MtPT1和MtPT2基因定位于根部，其表达水平与磷酸盐缺乏程度成正比。这两个启动子有略微不同，MtPT1启动子启动基因在根表皮细胞及根毛中表达，MtPT2启动子引导基因在根表皮、维管柱以及导管组织中表达［41］。启动子元件分析表明，根特异性调控元件“ATATT”是磷酸盐转运蛋白启动子的重要调控元件。在大麦中发现的磷酸盐转运蛋白基因HvPht1和HvPht2（表1序号15、16）属于Pht1基因家族，在大麦的根部有很强的表达活性；Pht1基因家族的启动子中都包含一个P1BS（GNATATNC）的磷离子应答元件，表现出强的磷酸盐敏感性［42］。HvPht1和HvPht2启动子引导gfp基因在根部特异性表达，尤其是在根毛细胞中，在叶片中也有微量表达［42］，此类启动子同时具有根表达特异性以及磷酸盐应答性特点，是植物转基因工程应用的有力工具。

2 非植物来源的根特异性启动子

除了从植物自身基因中克隆根特异性启动子外，非植物基因中也含有大量特异表达的启动子，它们同样具有很强的根组织特异表达活性，这类启动子在应用上可能会发挥出更大的潜能。

2.1 豆血红蛋白启动子

豆科植物根部由于根瘤菌侵入根部皮层细胞而形成的瘤状突起，即为根瘤［43］。在根瘤菌侵染植物根部细胞过程中，血红蛋白基因pVfLb29（表1序号17）参与根细胞对一氧化氮的解毒，从而防止细胞死亡。在根瘤菌与植物根系共生作用中pVfLb29基因还参与了抑制植物根细胞防御基因启动的过程［44］。豆血红蛋白基因pVfLb29能够在根瘤细胞和菌根真菌丛枝状细胞中特异性表达，该基因的启动子在-410到-326区域包含顺式调控元件AAAGAT及CTCTT；这两个调控元件是根瘤细胞表达过程中的必须元件，在其他豆类血红蛋白基因启动子中也普遍存在［45］。pVfLb29启动子-350/-358区域出现的AATATTAAA元件，与黄豆血红蛋白基因lbc3启动子（表1序号19）中的调控序列同源，并且在黄豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因GmPEPC7的启动子中，该调控序列也发挥着重要的作用［2］。另外，位于pVfLb29启动子-410/-326处，有14 bp的回文序列TATTAAA，在GmPEPC7启动子（表1序号18）中存在相似元件，其特异性表达调控机制也是相似的［46］。

pVfLb29启动子不仅在根瘤侵染的根细胞中有表达活性，而且在菌根真菌的丛枝状细胞中也同样表达［44］，为人们对根瘤特异表达启动子研究提供了线索和利用的信息。根瘤菌是豆科植物重要的互生真菌，也是农业生产轮作的有利真菌。根瘤特异启动子在实际生产应用中有很大的利用价值。

2.2 绿豆黄化镶嵌双粒病毒启动子

绿豆黄化镶嵌双粒病毒（MYMV）入侵植物的根部，并在根细胞中复制，其单向启动子TrAP/REn（表1序号20）包含很多根特异表达元件［47-49］。双粒病毒含有两个环状DNA-DNA A和DNA B，它们依赖宿主转录机制完成复制［50］。两基因间隔区域含有调控元件，除了TATA盒和G盒这些必要的元件外，还含有的根特异调控元件包括：ATATT、GCCAC、CTCTT、KCACGW及ROOTMOTIFPOX1等［49］。Shivaprasad等［51］研究发现，可能由于植物叶片中有关蛋白的影响，TrAP/Ren启动子只能驱动gus基因在根部表达，而在植物的叶片中只有该基因转录物的少量积累，所以，TrAP/Ren启动子呈现出根特异表达特性。另外，该病毒载体对植物没有毒害影响，而病毒组成型启动子会对植物造成伤害［52］，因此TrAP/Ren启动子可以作为植物基因工程中根特异性表达研究的有用工具［49］。MYMV 的TrAP/Ren启动子的发现和利用为根组织特异性表达研究提供了新的来源，对根特异性表达模式研究是重要补充。

3 展望

近年来，人们在启动子研究方面展开了大量的工作，不仅克隆了数量丰富的启动子，而且对其结构和功能有了一定的认识。启动子不仅直接影响转入基因的表达水平，而且精细调控其表达的组织特异性［53］。为使目标基因在转基因植物中有效、准确的表达，启动子的选择是关键。基于对基因表达调控转录水平的研究，需要对其顺式作用元件、反式作用因子的特性进行鉴定，进而了解在调控转录过程中它们的相互作用关系。作为植物重要的营养器官，关于植物根的研究在不断的扩展，根特异性启动子的研究也成为植物根发育和转基因研究中的重要部分［5］。

目前发现的植物根特异性表达的启动子并不多，同一启动子在不同植物间的启动效率也有差异。下一步的工作可针对启动子调控元件的分析，探索基因特异性表达调控的分子机理，以期获得更多有利用价值的根特异性启动子，有应用价值的启动子元件也可以投入到实际应用之中。鉴于已发现的根特异性启动子的调控缺陷，将调控根特异表达的元件组合利用在未来的研究工作中也会成为可能。植物的根关乎植物生长发育的根本，尤其是粮食作物与人类的生产生活关系密切，因此植物根特异性启动子的研究和应用将带来巨大的科研价值和商业价值。

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