针灸联合中药通过抑制胰岛细胞的凋亡发挥对糖尿病大鼠的治疗作用＊

胥 冰 刘 娟 田 磊 马晓军 陕西中医学院医学技术系（咸阳712046）

糖尿病（diabetes）是由遗传因素、免疫功能紊乱等各种因素作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征。糖尿病人表现为血糖升高，胰岛素的水平降低，其发病机制可能和胰岛β细胞的凋亡相关。糖尿病在中医称之为消渴，古代医家在论述消渴病机时大多以阴虚燥热立论，阴虚为本，燥热为标。因此中医治疗糖尿病多采用滋阴清热、生津、滋肾等法。白芍苦酸微寒，养血敛阴，甘草舒筋活络，酸甘化阴，二药合用共奏养阴生津，润燥清热之效。近来采用毫针刺，电针、艾灸、穴位注射等针灸方法治疗糖尿病也取得了较好的疗效［1］。但是白芍、甘草或者针灸治疗糖尿病的机制尚未阐明，它们是否通过调节bcl－2mRNA 的表达促胰岛细胞生存，延长胰岛细胞寿命，抑制细胞的凋亡对胰岛细胞发挥保护作用目前尚不清楚。本研究采用腹腔注射STZ 复制糖尿病大鼠模型，观察针灸或白芍、甘草对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤的影响及其机制，以探讨其治疗糖尿病的作用机制。

材料和方法

1 动 物 健康SD 大鼠雌雄各半50只，4～6周龄，体重200±10g，购自西安交通大学实验动物中心，合格证号：SCXK（陕）2007～001。各组大鼠分笼饲养，术前12h禁食，不禁水，室温饲养。

2 药品、试剂和仪器 链脲佐菌素（STZ），购于sigmaaldrich公司（D130）；葡萄糖测定试剂盒GOD－PAP法购于上海荣盛生物技术有限公司；胰岛素测定试剂盒（FINS）购于上海荣盛生物技术有限公司；Bcl－2免疫组化SABC 试剂盒，购于上海微晶生物技术有限公司；白芍和甘草均选用生药，将二药两次煎煮后的药液分别过滤，合并滤液，浓缩制成100%（W／V）浓度，相当于1g／mL 生药置4℃保存备用。蔡氏显微镜（德国产）、723分光光度计（上海光谱仪器公司）、高速冷冻离心机（日立）。

3 实验动物分组及造模 健康SD 大鼠雌雄各半50只（4～6周龄，体重200±10g），适应性喂养1w 后，随机分为5组（n＝10）：空白组；模型组；针灸治疗组；中药治疗组；针灸＋中药组。除空白组外，其余各组大鼠经腹腔注射STZ（45mg／kg，1次）［1］，72h后，测定大鼠空腹血糖，选取血糖≥11.1mmol／L 的大鼠为造模成功。

4 治疗方法 空白组，普通饲料喂养8周后，一次性腹腔注射PH4.2，0.1moL／l柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液。针灸组取①肺俞、胰俞、脾俞及肾俞；②关元、中脘、三阴交、足三里。第一组均向脊柱方向斜刺入0.5～0.8cm，第二组均垂直进针，0.2～0.5cm，至针下沉紧后，行捻转补法（小幅度快速捻转10s），留针30min，每隔10min行针1次，1次／d，出针前再行补法（手法同前）［1］；第一天针刺第一组穴位，第二天用第二组穴位治疗，两组穴位隔天交替针刺8个疗程（6d为1疗程）；中药组给予白芍甘草汤灌胃（10mL／kg，1次／d）7w。针灸＋中药组在针灸同时联合白芍甘草汤灌胃。

5 标本采集与检测 各组动物于7w 后麻醉处死，于空腹12h后将各组大鼠用10%戊巴比妥麻醉，心脏采血，5mL／只。采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖（FBG）；采用放射免疫法测定FINS含量，剖腹取胰腺和肝脏，取胰腺组织采用SABC 法（抗生物素过氧化物酶复合物法）技术检测大鼠胰腺组织中Bcl－2mRNA 的表达变化。

5.1 空腹血糖测定 采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖（FBG）。

5.2 血清中胰岛素水平检测 空腹12h后于大鼠眼眶采取静脉血测定，采用放射免疫法测定FINS含量。

5.3 胰腺组织中bcl－2mRNA 基因蛋白的表达变化检测 采用SABC法（抗生物素过氧化物酶复合物法）染色，并按照试剂盒说明操作进行检测。用Olympus BH－2显微镜观察并摄片，采用病理图像分析系统对染色结果进行半定量检测。

实验结果

1 血糖水平的变化 如图1所示，模型组血糖的水平明显升高，与空白组比较有显著性差异（P＝0.0033，P ＜0.01）；而针灸＋中药组血糖的水平明显降低，与模型组相比差异具有显著性（P＝0.057，P ＜0.01）；针灸治疗组或中药治疗组虽然血糖的水平降低，但是与模型组相比差异无显著性。

2 血清胰岛素水平的变化 如图2所示，模型组血中胰岛素的水平明显降低、与空白组比较有显著性差异（P ＜0.01）；而针灸＋中药组血中胰岛素的水平明显升高，与模型组相比差异具有显著性（P ＜0.01）；针灸治疗组或中药治疗组虽然血中胰岛素的水平升高，但是与模型组相比差异无显著性。

图1 各组血糖的变化

图2 各组血胰岛素的变化

3 胰腺组织bcl－2mRNA 的表达变化 如图3、图4所示，模型组胰腺bcl－2的表达显著降低，与空白组比较有显著性差异（P ＜0.01）；而针灸＋中药组胰腺bcl－2的表达显著增加，与模型组相比差异具有显著性（P ＜0.05）；针灸治疗组或中药治疗组胰腺bcl－2的表达增加，但是与模型组相比差异无显著性。

图3 各组胰腺组织bcl－2的变化

图4 各组胰腺组织bcl－2的变化

讨 论 腹腔内注射STZ复制大鼠糖尿病，是研究糖尿病较为理想的动物模型之一。我们经大鼠腹腔注射STZ（45mg／kg，1次），72h后测定大鼠空腹血糖，其中80%以上血糖值≥11.1mmol／L。提示腹腔内注射STZ（45mg／kg，1 次），成功复制了大鼠糖尿病模型。尽管糖尿病的病因及发病机制尚未完全明了，国内外研究一般认为胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损是糖尿病两个最重要的发病因素。就目前对其发病机制的研究来看，β细胞功能衰退在其发病中起了决定性的作用，胰岛β细胞损伤是糖尿病的重要发病机制［2］。在细胞凋亡的过程中，bcl－2是重要的凋亡调节蛋白，在糖尿病的形成过程中起有重要作用。bcl－2 是B 细胞淋巴瘤／白血病－2 基因（B－celllymphoma leukemia－2）的缩写，是bcl－2家族成员中主要的抗凋亡因子，在抵抗细胞凋亡及延长细胞寿命方面的作用最具代表性，在胰岛细胞凋亡过程中Bcl－2mRNA 表达水平降低，促进了凋亡发生。而Bcl－2 基因转染的胰岛β细胞则能防止细胞因子诱导的β细胞凋亡。在人体，高血糖能够抑制胰岛素的释放并增加胰岛β细胞凋亡，这种作用与葡萄糖浓度呈现一种剂量依赖的模式，高葡萄糖通过改变bcl家族之间的平衡，使β细胞产生释放白介素1β，导致凋亡通路的激活（NF－KB 激活，FAS上调，DNA 破碎），促使β细胞凋亡［3］。而bcl－2 可以直接或间接阻止影响凋亡蛋白酶激活的关键因素细胞色素C 从线粒体释放，并能抑制线粒体通透性转换孔开放，阻止细胞凋亡。近年来，中医药在防治糖尿病方面表现出巨大的潜力，无论是单味中药还是中药复方，在治疗糖尿病方面均显示出很大优势［4，5］。有研究表明，中药复方能够上调糖尿病大鼠凋亡抑制基因bcl－2表达，从而抑制糖尿病胰腺β细胞的凋亡，促细胞生存，延长细胞寿命。针灸也可有效抑制2型糖尿病胰岛β细胞凋亡。我们分别采用针刺、白芍＋甘草及针刺联合白芍甘草对STZ诱导的大鼠糖尿病进行治疗发现：针刺＋中药可以有效提高血中胰岛素的水平，降低血糖水平，改善胰岛的病理损伤。另外，我们还发现针刺＋中药可以从mRNA 水平增强胰腺bcl－2的表达，提示针刺联合中药能有效促进胰岛素分泌，发挥降血糖的功效。其机制可能与调节Bcl－2的表达从而抑制胰岛细胞的凋亡有关。

［1］ 梁兴伦，韩明向.胰岛素抵抗模型大鼠的中医证候研究［J］.中国中西医结合杂志，2001，7：528.

［2］ 杨立勇，吴佩文.细胞因子介导的2型糖尿病β细胞损伤机制［J］.国外医学内分泌学分册，2005，25（1）：13－15.

［3］ Piro S，AnelloM，Di Pietro C，et al.Chronic exposure to free fatty acid or high glucose induces apoptosis in rat pancreatic islets：possible role of oxidative stress.Metabolism，2002，51：1340－1347.

［4］ 臧乐红，杨玉青.针刺联合直流电药物离子导入治疗糖尿病性眼肌麻痹31例［J］.陕西中医，2012，33（5）：588－589.

［5］ 林 瑛，闫林西.参芪地黄散配合西药治疗2型糖尿病疗效观察［J］.陕西中医，2012，33（4）：418－419.