MNNG诱导GES-1细胞恶性转化细胞模型的建立

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(1 青岛大学医学院药学系,山东 青岛 266021； 2 青岛大学医学院附属医院药剂科； 3 中国海洋大学分子药理室)

胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一, 其发生率和死亡率在各类肿瘤中仍居首位。胃癌在癌变前多数经历了较长的演变，目前较公认的胃癌发病模式为正常胃黏膜→肠上皮化生→异型增生→胃癌[1]。在这里发生了上皮细胞间质化(EMT)过程[2-5]。目前研究证实，胃癌与饮食因素中的亚硝基化合物, 尤其是亚硝胺类化合物有关[2]。本研究以N-甲基-N′-硝基N-亚硝基胍(MNNG)作用于永生化的人类胃黏膜上皮细胞GES-1[3]，系统地观察细胞形态的变化，同时检测细胞中神经钙黏附素(N-cadherin)与磷酸化信号传导和转录激活因子3(P-STAT3)表达的改变,为今后深入研究EMT靶向药物提供细胞模型。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 细胞株

永生化的人胃黏膜上皮细胞系GES-1购自中国科学院上海细胞库。

1.2 试剂

MNNG系美国Sigama公司产品，1640培养液、胎牛血清系美国GIBCO公司产品，抗体N-cadherin、P-STAT3、HRP-羊抗鼠二抗、HRP-羊抗兔二抗均系美国Cell Signalin公司产品，β-actin抗体系美国Santa Cruz公司产品，ECL发光试剂系美国Thermo公司产品，一抗、二抗去除液系碧云天生物科技有限公司产品。

1.3 仪器与设备

超净工作台、台式高速冷冻离心机、CO2培养箱系德国Heraeus公司产品，蛋白电泳系统系美国BIORAD公司产品，凝胶扫描成像系统系北京赛智创业科技有限公司产品，半干转膜仪系大连竟迈生物科技有限公司产品。

1.4 实验方法

1.4.1GES-1细胞培养 GES-1细胞在1640培养液(含体积分数0.10胎牛血清)中，于37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下培养,取对数生长期的细胞用于实验。

1.4.2MNNG诱导GES-1细胞转化 取对数生长期的GES-1细胞2.0×105个，种于60 mm培养皿中，每皿加入5 mL培养液，于37 ℃、含体积分数0.05 CO2条件下培养过夜，加入2.0×10-5mol/L MNNG，避光培养24 h后，换新鲜1640培养液(含体积分数0.10胎牛血清)培养，1周左右可见大量细胞死亡脱落，残存的细胞2周后长至70%～80%的饱和度时开始按GES-1细胞培养法消化传代，传至第4代时，冻存留用。

1.4.3GES-1、MC细胞中胃癌相关蛋白N-cadherin、P-STAT3表达的测定 分别取对数生长期的GES-1、MC细胞2.0×104个，种于6孔板中，每孔加3 mL培养液，于37 ℃，体积分数0.05 CO2条件下培养过夜；收集细胞，制备蛋白电泳样品，用预冷的PBS洗3次，各孔加入90 μL细胞裂解液，冰浴裂解30～40 min；刮取细胞裂解液，沸水煮5 min使蛋白变性，-20 ℃保存。采用Western Blot方法检测N-cadherin与P-STAT3蛋白表达。

2 结 果

2.1 细胞形态学改变

GES-1细胞形态随着继续传代从初始建株时的上皮样细胞逐渐变为梭形，细胞之间排列稀疏，呈散在性生长。经过MNNG处理后的细胞从初始的梭形，随传代的继续形态逐渐变为不规则，细胞间接触紧密，呈“岛样”克隆生长，克隆间界限清楚，以梭形细胞环绕。多数细胞具有单核，也出现多核巨大细胞，胞浆内可见空泡，命名为MC细胞。见图1、2。

2.2 GES-1、MC细胞中胃癌相关蛋白N-cadherin表达的检测

实验结果显示，MNNG诱导过后胃癌相关蛋白N-cadherin的表达量增多。见图3。

2.3 GES-1、MC细胞中胃癌相关炎症蛋白P-STAT3表达的检测

实验结果显示，MNNG诱导过后P-STAT3 的表达量增多。见图4。

3 讨 论

EMT是指上皮细胞在正常的生理和特定的病理情况下向间充质细胞转化的现象，是以上皮细胞丧失极性和黏附性并获得间质特性为主要特征的一个复杂过程。在此过程中，一个重要的分子事件就是钙黏蛋白表达的异常[6]，N-cadherin属于钙黏蛋白家族,为目前已知的与肿瘤转移有关的黏附分子之一，N-cadherin与细胞间的黏附、分化、侵袭和信号传导有关。N-cadherin在上皮细胞中,可促使细胞形态向成纤维细胞发展,是细胞侵袭、浸润的促进者[7]。N-cadherin只表达于成熟的神经、肌肉和造血组织等神经外胚层和中胚层来源的组织，正常上皮组织往往不表达，这种N-cadherin在上皮组织中的异位表达可影响上皮细胞的形态和行为，诱导其发生向间质的转化，即发生EMT。本实验结果显示，MNNG可以诱导GES-1细胞发生成纤维细胞样形态改变，并导致N-cadherin分子高表达，表明MNNG诱导的GES-1细胞发生了EMT转化。

图1GES-1细胞形态

图2MC细胞形态

图3 胃癌相关蛋白N-cadherin的表达

图4 胃癌相关炎症蛋白P-STAT3的表达

研究显示，STAT3及其磷酸化形式P-STAT3在人类多种恶性肿瘤，如胃癌、头颈部鳞状细胞癌、乳癌、结直肠癌等组织中均存在异常高表达或活性增强[8]。有研究认为，P-STAT3表达与胃癌侵袭、转移及预后相关[9]。P-STAT3蛋白可以作为胃癌诊断和预后判断的分子标志物，有望为深入研究胃癌的诊断与治疗提供新的思路。本实验结果显示，MNNG诱导的GES-1细胞高表达P-STAT3，进一步说明MNNG作用后GES-1细胞具有了胃癌细胞的性质。

GES-1细胞是由人胎儿胃黏膜上皮细胞转染SV-40病毒后获得的永生化的细胞系，可以在体外稳定传代,但保留了正常的细胞骨架结构,在裸鼠体内不致瘤,在软琼脂中也不形成集落,被认为在体外研究胃黏膜的癌变有较大价值[4]。

本研究使用与胃癌相关的亚硝胺类化合物MNNG对永生化的人胃黏膜上皮细胞系GES-1进行恶性转化实验,成功诱导得到了胃癌癌前病变的细胞，为深入研究治疗EMT的靶向药物提供了一种细胞模型。

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