响应面法超声辅助提取优化蛇床子素工艺的研究

陈 慧，李雪虎，陆锡宏，杨贤鹏，梁剑平*

1中国科学院近代物理研究所，兰州730000;2 甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州730070

独活(Radix Angelicae Pubescentis)为伞形科植物重齿毛当归的干燥根［1］，主产于四川、湖北、安徽等地，是一种比较常见的中药。主要有祛风除湿、通痹止痛等功效。据文献报道，香豆素类化合物是独活中所含的最主要活性成分，其中又以蛇床子素(Osthole)含量最高［2］，独活具有抗炎镇痛［3］、抗氧化［4］、抗血管生成作用［5］，其作用与蛇床子素成分密切相关。此外，还有挥发油、有机酸等［6］。独活中蛇床子素由于具有较好的药理活性受到了越来越多研究者的关注。目前，天然产物中有效成分的传统提取方法有醇渗漉法、浸渍法、索氏抽提法和加热回流法。但这些提取方法存在提取时间长、溶剂用量大、提取率低等问题。近年来，现代提取技术超声提取法具有设备简单、操作时间短、效率高等优点，已广泛用于提取天然产物中挥发油、苷类多糖、生物碱等有效成分［7］。经查阅，前人［8，9］多采用单因子或正交实验，实验无法找到最佳因素水平组合。目前还未见采用响应面法超声辅助提取独活的报道，为此，本文以独活为试验材料，通过对独活超声波辅助提取过程中液料比(浸提液体积与独活质量的比值)、乙醇体积分数、提取时间以及提取温度等因素与蛇床子素得率关系的研究，结合响应面法对蛇床子素提取工艺进行优化筛选，旨在获得最佳提取工艺，为独活的综合利用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

独活(西藏农科院提供，由兰州大学第二附属医院王晓飞博士鉴定);乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、乙醇、氯仿、氨水、盐酸;去离子水，本实验室自制;其余试剂均为分析纯。蛇床子素(中国药品生物制品检定所)。

1.2 仪器

高效液相色谱仪，美国Waterse2695;DFT-250手提式高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司;KH-300DB 型数控超声清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司;旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司;Pine-tree 纯水机，北京湘顺源科技有限公司。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent EclipseXDB-C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相:乙腈-水(60∶40)，等度洗脱;体积流量1.0 mL/min;检测波长322 nm;柱温25 ℃;进样体积10 μL;HPLC 色谱图如图1 所示。

图1 蛇床子素标准品(a)和样品(b)的HPLC 图Fig.1 HPLC chromatograms of standard (a)and sample (b)

2.2 对照品溶液的制备

精密称取蛇床子素对照品7.4 mg，加甲醇制成含蛇床子素0.74 mg/mL 的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取独活干膏0.2 g，加入甲醇少量，超声20 min 溶解后，放冷，滤过，置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取续滤液经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.4 标准曲线的绘制

精密称取蛇床子素对照品7.4 mg，加入甲醇使溶解并定容于10 mL 量瓶中，精确量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，于2 mL 容量瓶中，用甲醇定容，摇匀即得。用0.45 μm 微孔滤膜滤过后，分别进样每个质量浓度重复3 次，测定峰面积积分值。以蛇床子素质量浓度对峰面积平均值进行线性回归，得回归方程Y =4E +07X +85203(R2=0.9993)在74.00～444.00 μg 与峰面积呈良好线性相关。

2.5 提取工艺流程

独活→洗净烘干→粉碎过筛→加入提取剂→超声提取→减压浓缩回收提取剂→0.3%盐酸溶液溶解→过滤(氨水调pH 为9-11)→氯仿萃取→甲醇定容→计算粗品中蛇床子素含量

2.6 浸提条件的选择

研究温度(40、50、60、70、80 ℃)，乙醇溶液体积分数(55%、65%、75%、85%、95%)，料液比(10、15、20、25、30 mL/g)和提取时间(20、30、40、50、60 min)对独活提取率的影响，首先做单因素实验考察以上条件对提取率的影响，然后采用响应面分析法优化最佳工艺条件。试验均进行三次，取平均值。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验结果

3.1.1 提取温度对独活中蛇床子素提取率的影响

在体积分数75%，提取时间为40 min，料液比为20 mL/g 的提取条件下，分别考察不同超声温度对蛇床子素提取，提取次数为3 次。超声温度对提取率的影响，如图2 所示，随着提取温度的上升，蛇床子素提取率呈现逐渐增大的趋势，但温度超过60℃，提取率反而下降。分析原因是:从较低温度升至60 ℃，热效率升高，分子运动加快，利于蛇床子素的破壁溶出;但随着温度的继续升高，使部分蛋白凝固从而不利于蛇床子素溶出，故提取率下降，因此选择提取温度为60 ℃左右较为合适。

图2 提取温度对蛇床子素提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on the yield of osthole

3.1.2 乙醇体积分数对独活中蛇床子素提取率的影响

在提取温度60 ℃，超声时间40 min，液料比20 mL/g 的提取条件下，分别用不同体积分数乙醇对独活进行提取，提取次数为3 次。提取溶剂体积分数对提取率的影响，如图3 所示。随着乙醇体积分数的增大，蛇床子素提取率先增大后减小。这是因为乙醇对蛇床子素的溶解度比水大，乙醇对细胞的破坏作用比水强，在超声波作用下表现得更加明显。乙醇体积分数在75%时，独活中的蛇床子素提取率较高，考虑到乙醇体积分数过高会增加生产成本。因此选取75%乙醇作为提取溶剂。

图3 乙醇体积分数对蛇床子素提取率的影响Fig.3 Effect of percentage of ethanol on the yield of osthole

3.1.3 提取时间对独活中蛇床子素提取率的影响

在乙醇体积分数75%，液料比20 mL/g，提取温度60 ℃的提取条件下，分别用不同的超声时间对独活进行提取。提取时间对提取率的影响如图4 所示由图可知。随着超声作用时间的增加，独活中蛇床子素的提取率迅速增大，可见提取时间越长，提取越充分。但时间超过40 min 后，蛇床子素提取率有所下降，因此选择提取时间为40 min 左右较为合适。

图4 提取时间对蛇床子素提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of osthole

3.1.4 料液比对独活中蛇床子素提取率的影响

在提取温度60 ℃，乙醇体积分数75%，超声时间60 min 的提取条件下，分别用不同的料液比对独活进行提取。料液比对提取率的影响如图5 可知，随着溶剂量的增加，蛇床子素含量呈现先升高后降低的趋势。当料液比低于1∶20 时，提取率随着料液比的增大而升高，这是因为提取率的高低与蛇床子素向溶剂扩散的难易程度有关，料液比小，溶剂量少，导致两相界面间的浓度差小，不利于蛇床子素的扩散。但当料液比高于1∶20 时，提取率变化不明显，而且成本增加，不利用工业生产，因此最佳提取料液比为1∶20。

图5 水料比对蛇床子素提取率的影响Fig.5 Effect of solvent/material ratio on the yield of osthole

3.1.5 提取次数对独活中蛇床子素提取率的影响

以超声温度60 ℃，75%乙醇为溶剂，1∶20 料液比，40 min 超声时间作为条件考查不同提取次数对独活中蛇床子素提取率的影响。如图6 所示，随着提取次数的增加提取率逐渐增大，在提取次数到大3 时，提取率趋于稳定，但随着提取次数的增加所耗费的溶剂和成本也急剧增加，综合各种因素考虑本试验选定提取3 次为宜，既减少后期浓缩的困难，又节省能耗。

图6 提取次数对蛇床子素提取率的影响Fig.6 Effect of extraction times on the yield of osthole

3.2 四元二次回归正交旋转组合试验设计

3.2.1 蛇床子素提取率回归方程的建立与检验

为了确定在多因素条件下超声波提取蛇床子素的最佳工艺，本文在单因素试验的基础上，选择合适的参数范围，对提取温度、乙醇体积分数、提取时间、液料比4 个因素进行二次回归正交旋转组合设计试验，以蛇床子素的提取率为评价指标，优化蛇床子素的最佳提取工艺，试验自变量因素编码及水平见表1。

表1 实验因素水平表及编码Table 1 Code and level of factors chosen for the trials

利用二次回归正交旋转组合设计试验，试验方案及试验结果见表2。

表2 响应面分析实验设计及实验结果Table 2 Design and experimental result of research surface methodology

2500000.959 2700000.978 2800000.985 2900000.987 3000000.969

根据表2 的结果，应用Design-Expert 7.0.0 软件进行编程计算，通过其响应面回归(RSREG)程序进行数据分析，得出回归模型，回归方程为:Y=0.98+ 0.019X1-0.0017X2+ 0.023X3+ 0.016X4-0.011X1X2-0. 00288X1X3-0. 00338X1X4-0.00388X2X3-0. 014X2X4-0.013X3X4-0.02X-0.03X-0.02X-0.037X。

表3 回归模型统计分析结果Table 3 Results of statistical analysis for regression coefficients of model

由表3 回归方差显著性检验表明，一次项超声提取温度、时间对蛇床子素得率的线性效应极显著，料液比对蛇床子素得率的线性效应显著;二次项超声提取温度、乙醇浓度、时间、料液比对蛇床子素提取率的曲面效应极显著;比较各因子间交互作用不显著。在本实验设计范围内回归方程显著性检测P=0.01，极显著，模型的确定系数为0.8981，说明该模型能解释89.81%响应值的变化，即该模型与实际实验拟合良好，试验误差小，回归方程失拟检验不显著，表明未知因素对试验结果干扰很小。在本实验中温度和时间是影响蛇床子素提取最重要的两个因素，在适当的温度和时间的条件下，提取蛇床子素能达到最大值，且X1(温度)＞X3(时间)＞X4(料液比)＞X2(乙醇体积分数);同时可以看出，各因素交互作用都不显著。通过得出的模型，得到的最优条件。最优条件下即提取温度为64.63 ℃，乙醇体积分数为73.18%，提取时间为45.33 min，料液比为20.67 mL/g。

3.2.2 响应面分析

图7 是通过多元回归方程所做的响应曲面图及其等高线图，所拟合的响应曲面和等高线图能比较直观地反映各因素和各因素间的交互作用。等高线图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响，椭圆形反映了两因素的交互作用较强，而圆形则相反，由图7 可以看出，6 个响应曲面均为开口向下的凸形曲面，随着每个因素的增大，响应值增大;当响应值增大到极值后，随着因素的增大，响应值逐渐减小;比较6 组图及数据可得出X1、X2、X3、X4及各因素之间的交互作用对蛇床子素提取率的影响。从图7a 中可以看出，固定提取时间40 min、液料比20 mL/g 的水平下，蛇床子素含量随着乙醇体积分数及提取温度的加大而急剧增加，表现为等高线更为陡峭;且乙醇体积分数对蛇床子素含量的影响较提取时间明显。而当体积分数超过75%，提取温度超过60 ℃时，蛇床子素含量增加变缓，等高线形状逐渐向椭圆形发展，这说明乙醇体积分数与提取温度之间有较强的交互作用。从图7b 可以看出，固定体积分数75%、液料比20 mL/g 的水平下，开始蛇床子素随着提取时间与提取温度的增加而增加，但当提取温度超过60 ℃，提取时间超45 min 后，蛇床子素含量增加缓慢，而且等高线也逐渐呈现椭圆形状，这说明在蛇床子素含量缓慢达到最高值后仍有下降趋势。这充分表明提取时间与提取温度两个因素的有一定交互作用。从图7c 中可看出，等高线呈现明显椭圆形，这表明在固定乙醇体积分数75%，提取时间45 min 水平下，蛇床子素含量随着提取温度及料液比的加大而急剧增加，表现为等高线更为陡峭;料液比对蛇床子素含量的影响较提取温度明显。这说明料液比与提取温度之间有较强的交互作用。从图7 d 中看出，等高线呈现椭圆形不是很明显，在固定提取温度60 ℃、液料比20 mL/g 的水平下，蛇床子素含量随着提取时间的延长和乙醇体积分数的升高而增加，当提取时间超过45 min，同时乙醇的体积分数超过75%后。等高线变化比较平滑，可知提取时间与体积分数的交互作用不明显。从图7e 中可以看出，当固定提取时间45 min、提取温度60 ℃水平下，蛇床子素含量随着液料比的增大而先增加，然后又有降低的趋势，从而表现为单位时间内蛇床子素含量相对下降。另等高线形状也逐渐呈现椭圆形状，变化比较陡，得知体积分数和液料比之间有显著性交互作用。图7f 中的等高线形状呈圆形，提取时间与液料比的有着显著的交互作用。通过响应曲面交互作用分析，可发现各因素之间的交互作用对蛇床子素含量有重要影响。

3.2.3 验证实验

结合实际操作，把最优条件调整为温度为65℃，乙醇体积分数75%，提取时间为45 min，料液比为20 mL/g。并在此调整的最优条件下平行提取3次，得到提取率分别为0.964%、0.978%、0.986%取平均值0.976%。经测定，此值与理论值的误差为0.011%，即RSD =0.011%，说明模型能较好的预测实际提取率。

4 讨论

单因素实验结果表明，蛇床子素的提取率的趋势随着提取温度升高，乙醇浓度的增大，提取时间延长及料液比升高的增大而增大;而随着提取时间延长及料液比的增加，蛇床子素提取率的趋势是先增大后减小;提取次数为3 次时，独活中的蛇床子素几乎可以被提取完全。

响应面实验结果表明，温度、时间对实验结果有极显著的影响，乙醇体积分数对实验结果有显著影响，而料液比对实验结果影响不显著;得到的回归方程Y=0.98+0.019X1-0.0017X2+0.023X3+0.016X4-0.011X1X2-0.00288X1X3-0.00338X1X4-0.00388X2X3-0.014X2X4-0.013X3X4-0.02X-0.03X22-0.02X-0.037X

图7 因素之间的响应曲面及等高线图Fig.7 RSM and contour line plots between different experimental factors

应用响应面分析法，确定超声提取蛇床子素的最优条件为:提取温度64.63 ℃，乙醇体积分数为73.18%，提取时间45.33 min，料液比为20.67 mL/g;但从实际的操作考虑，调整为提取温度为65 ℃，乙醇体积分数为75%，提取时间为45 min，料液比为20 mL/g。用上述实际的最佳条件进行提取，测得蛇床子素的提取率为0. 976%，相对标准误差RSD=0.011%，所建立的模型能较好的预测超声提取的实际提取率。

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