红杉醇对2 型糖尿病大鼠肝脏炎症损伤的保护作用*

陈祥攀， 杨解人， 郝 伟， 刘 艳， 李先伟

(皖南医学院国家中医药管理局中药药理三级实验室，安徽 芜湖241002)

随着糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率的增加，出现糖尿病并发症的患者逐年增多。对于糖尿病并发症人们关注最多的是血管及神经系统病变，而对于糖尿病合并肝脏损伤尤其是炎症病变研究较少，有研究表明糖尿病患者中合并肝脏病变高达50%以上［1］。目前，临床上均采用单一疗效的降糖药和保肝药，且不良反应较多。因此，研究高效、低毒、安全可靠的新型降血糖且具有保护肝脏作用的药物具有重要意义。红杉醇(sequoyitol，Seq)是从红豆杉等植物提取的一种天然化合物［2］。动物体内外实验表明，Seq 能明显竞争性抑制α-葡萄糖苷酶活性，促进脂肪细胞摄取葡萄糖、抑制肝糖原分解和葡萄糖吸收而显著降低DM 小鼠的血糖、降低血脂、改善自由基代谢和保护胰岛β 细胞［3-4］。故本研究采用高脂高糖饲料加小剂量STZ 诱导2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠模型，从炎症因子角度，以肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)为新靶点，探讨Seq 对DM 肝脏炎症损伤的保护作用及其可能机制，为临床应用提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 动物 清洁级健康雄性SD 大鼠60 只，体重(200 ±20)g，高糖高脂饲料(68.5%普通饲料、20%蔗糖、10%猪油、1%胆固醇和0.5%胆盐)和普通饲料均购自南京市江宁区青龙山动物试验中心。

1.2 药品 Seq 纯度70%，分子式C7H14O6，分子量194.1825(大连美仑生物技术有限公司)。STZ 粉剂(Sigma)。阿卡波糖(acarbose，Aca)每片50 mg(杭州中美华东制药有限公司)。

1.3 试剂 血糖(blood glucose，BG)、白蛋白(albumin，ALB)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)试剂盒(上海西门子医学诊断产品有限公司)。TNF-α、IL-6 和C 反应蛋白(C-reactive protein，CRP)ELISA 检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，R﹠D 公司进口分装)。TRIzol RNA提取试剂盒(Invitrogen)，PrimeScript 逆转录和SYBR real-time PCR 试剂盒(TaKaRa)，三(羟甲基)氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙稀酰胺、过硫酸胺和四甲基乙二胺(Amresco)，Tween-20(Sigma)，RIPA buffer 和苯甲基磺酰氟(江苏碧云天生物技术研究所)。

2 方法

2.1 DM 肝脏炎症损伤大鼠模型的建立 60 只大鼠经1 周适应性喂养，随机分为正常对照组(7 只)与DM 肝脏炎症损伤组(53 只)。对照组喂普通饲料，DM 肝脏炎症损伤组给以高脂饲料。饲养4 周后禁食12 h，模型组1 次性腹腔注射35 mg·kg-1STZ(0 ℃以下保存，临用前用0.1 mol·L-1pH 为4.4的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液在冰浴条件下配制成20 g·L-1的溶液)溶液，对照组腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液。72 h 后用血糖仪检测空腹血糖，凡连续5 d 测得随机空腹血糖≥11.1 mmol·L-1，ALT 和AST均高于正常对照组(P ＜0.01)视为成功模型，确认DM 肝脏炎症损伤模型40 只，血糖和肝功能不符合要求的13 只大鼠则被剔除。

2.2 动物分组、剂量设置及给药方法 取造模成功的DM 肝脏炎症损伤大鼠按预试结果设置如下组别和剂量:Seq 低剂量组(12.5 mg·kg-1·d-1，n =7)、Seq 中剂量组(25 mg·kg-1·d-1，n =7)、Seq 高剂量组(50 mg·kg-1·d-1，n =7)、Aca 阳性对照组(20 mg·kg-1·d-1，n=7)和模型组(双蒸水5.0 mg·kg-1·d-1，n =12)，另设正常对照组(双蒸水5.0 mg·kg-1·d-1，n =7)，按上述设定剂量，药物用双蒸水充分溶解后现配现用，于每天18:00 ～19:00 灌胃，持续6 周。其中模型组有5 只因高糖、肝功能损伤严重而死亡。

2.3 标本采集和制备 于末次给药后，大鼠称重，麻醉(戊巴比妥钠30 mg·kg-1，ip.)，腹主动脉采血后，取肝脏于4 ℃0.9% NaCl 冲洗，滤纸拭干，称湿重计算肝脏指数［5］:肝脏指数=肝脏重量(g)/体重(g)。

2.4 病理组织学检查 取相同部位肝脏，常规石蜡包埋、切片、HE 染色，光镜下观察肝脏病理组织学变化。

2.5 血糖和肝功能测定 取5 mL 血，4 ℃、3 000 r/min离心10 min 制备血清，采Dimension RxL Max全自动生化分析仪(西门子医学诊断产品上海有限公司)测定BG、ALB、ALT 和AST。

2.6 CRP、TNF-α 和IL-6 含量测定 取30%相同部位肝脏，充分研磨后以3 000 r/min 离心10 min，留取上清液，制备10%组织匀浆，用DNM-9602 酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)，按试剂盒说明书，ELISA 法测定肝组织匀浆CRP、TNF-α 和IL-6 含量。

2.7 荧光定量实时PCR 检测TNF-α mRNA 表达

采用TRIzol 提取肝脏RNA 后，PrimeScript 逆转录试剂盒进行逆转录反应，反应条件:37 ℃15 min，85 ℃5 s，反应体系:总RNA 5 μL，5 ×PrimeScript Buffer 2 μL，Random 6 mers 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，RNase-free dH2O 1.5 μL。所得cDNA 在荧光定量实时PCR 仪(7300 Real-Time PCR System，ABI)上进行反应，使用Power SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒，以2 μL cDNA为模板，以β-actino 为内参照，PCR 扩增基因片断(引物序列见表1)。反应条件:95 ℃30 s;95 ℃5 s，60 ℃31 s，40 个循环。反应体系:SYBR® Premix Ex TaqTM(2 ×)5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，ROX Reference Dye(50 ×)0.2 μL，RNase-free dH2O 2.4 μL，cDNA 2 μL。反应结束后，运行熔解曲线程序，分析产物特异性。用7300 System SDS Software 分析数据，统计各组ΔΔCt 值，计算相应RQ 值，比较各组mRNA 的表达水平。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

3 统计学处理

采用DAS 2.0 软件包进行统计学分析，数据以均数±标准差(mean ±SD)表示，多组均数比较采用单因素方差分析有LSD-t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠空腹BG 和肝脏指数的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠空腹BG 和肝脏指数明显升高(P ＜0.01);与模型组相比，Seq 高、中剂量组大鼠空腹BG 和肝脏指数显著降低(P ＜0.01)，见图1。以上结果说明Seq 能明显降低DM肝脏炎症损伤大鼠BG 和肝脏指数。

Figure 1. Effects of sequoyitol on fasting blood glucose (BG;A)and liver index (B)in type 2 diabetic rats with liver inflammatory lesions.Mean±SD.n=7. ＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.图1 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠空腹BG 和肝脏指数的影响

2 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠肝脏病理改变的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肝窦狭窄，结构不清，汇管区有炎症细胞浸润;小叶中央区及周边区大部分肝细胞肿胀，胞质中出现大小不等的以大泡性脂肪滴为主的脂滴空泡，核居边，细胞界限不清;并可见肝细胞点状或灶状坏死。与模型组相比，Seq组上述病理变化随剂量增加逐渐改善，尤其高剂量组改善较为明显，见图2。这说明Seq 具有减轻DM肝脏炎症损伤大鼠肝脏脂质堆积及炎性变的作用。

3 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠肝功能的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠血清ALT 和AST 活性明显增高而ALB 含量明显降低(P ＜0.01);与模型组相比，Seq 各剂量组大鼠血清ALT和AST活性不同程度降低，而ALB含量升高(P ＜0.05 或P ＜0.01)，见图3。这说明Seq 具有改善高糖高脂诱导DM 肝脏炎症损伤大鼠肝功能的作用。

Figure 2. HE staining of rat hepatic tissues in each group(×200).A:control group;B:model group;C:Seq 12. 5 mg·kg -1 group;D:Seq 25 mg·kg -1 group;E:Seq 50 mg·kg -1 group;F:Aca group.图2 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠肝脏病理改变的影响

Figure 3. Effects of sequoyitol on serum levels of ALT (A)，AST(B)and ALB (C)in type 2 diabetic rats with liver inflammatory lesions. Mean±SD.n=7. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.图3 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠肝功能的影响

4 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠肝脏CRP 的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肝脏CRP 含量显著升高(P ＜0.01);与模型组相比，Seq 各组大鼠CRP 含量明显降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，见图4，这说明Seq 具有降低2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠肝脏CRP 的作用。

5 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠肝组织TNFα 和IL-6 的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织TNF-α和IL-6 含量明显升高(P ＜0.05 或P ＜0.01);与模型组相比，Seq 各剂量组大鼠肝组织TNF-α 和IL-6含量明显降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，尤以高剂量组明显(P ＜0.01)，见图5。以上结果说明Seq 具有减轻DM 肝脏炎症损伤大鼠炎症的作用。

Figure 4. Effect of sequoyitol on hepatic CRP in type 2 diabetic rats with liver inflammatory lesions. Mean ± SD. n =7. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs model.图4 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠肝脏CRP 的影响

Figure 5. Effects of sequoyitol on hepatic TNF-α (A)and IL-6 (B)in type 2 diabetic rats with liver inflammatory lesions. Mean±SD.n=7. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.图5 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠肝组织TNF-α 和IL-6 的影响

6 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠肝组织TNFα mRNA 表达的影响

经real-time PCR 检测发现，与正常对照组相比，模型组TNF-α mRNA 表达水平明显升高(P ＜0.01);与模型组相比，Seq 各组均能抑制TNF-α mRNA 表达上调(P ＜0.05 或P ＜0.01)，见图6。

Figure 6. Effects of sequoyitol on hepatic TNF-α mRNA in type 2 diabetic rats with liver inflammatory lesions. Mean±SD.n=7. ＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs model.图6 Seq 对2 型DM 肝脏炎症损伤大鼠肝组织TNF-α mRNA 表达的影响

讨 论

肝脏是物质代谢的重要器官，也是常见的DM慢性损伤的靶器官之一［6］。DM 肝脏损伤包括形态和功能改变，其特征性病理表现为糖原沉积、脂肪变性、炎症细胞浸润、Mallary 小体形成及肝纤维化［7-9］。本实验采用高脂高糖饲料喂养10 周，第4 周腹腔注射35 mg·kg-1STZ 溶液制备2 型糖尿病大鼠模型。实验结果显示模型组大鼠血糖明显升高，肝功能严重受损，组织病理学检测显示出明显的肝细胞水肿、点状或灶状坏死，肝小叶中肝窦狭窄，汇管区炎症细胞浸润，表明STZ+高糖高脂诱导的DM 肝脏炎症损伤模型已成功复制，与文献报道相一致［10-11］。

研究显示红杉醇具有明显的降糖作用［2-4］，本实验发现，随着红杉醇的剂量增加，DM 肝病大鼠的血糖逐渐下降，肝脏指数减小;肝细胞水肿、点状或灶状坏死及炎症细胞浸润等均有不同程度的改善。生化指标检测进一步证明红杉醇能明显改善糖尿病肝损伤的肝功能，升高血清白蛋白含量。这些结果表明，红杉醇不仅能够降低DM 大鼠的血糖，同时具有保肝、改善DM 肝脏炎症损伤的作用。

文献报道，在糖尿病肝损伤中活性氧簇可诱导肝组织释放TNF-α、IL-6 等，TNF-α 通过干扰线粒体呼吸链并形成超氧阴离子而增加线粒体膜的通透性，加剧线粒体损伤［12-13］;IL-6 等激活Kupffer 细胞，活化的Kupffer 细胞可以继续分泌细胞因子和炎症介质，进一步加重肝损伤并诱导肝纤维化［10，14］，罗布麻宁可通过降低DM 小鼠心肌TNF-α 表达提高心脏功能［15］。本研究显示，炎症因子TNF-α、IL-6 在模型组大鼠肝组织含量明显升高，经real-time PCR 检测发现，模型组TNF-α mRNA 的表达水平也显著升高，肝功能受损明显，提示炎症因子可能是引起肝功能受损的原因之一。而经红杉醇治疗后肝组织TNFα mRNA、TNF-α 及IL-6 水平明显降低，提示红杉醇可以通过降低大鼠肝脏TNF-α 和IL-6 表达而改善肝脏功能。但红杉醇是通过何种机制调节TNF-α 和IL-6 的表达，有待进一步研究。

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