杀菌/通透性增加蛋白基因Glu216Lys 多态性与中国汉族人群炎症性肠病无关

杨庆帆， 陈白莉， 张青森， 何 瑶， 陈旻湖， 曾志荣

(中山大学附属第一医院消化内科，广东 广州510080)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是胃肠道的慢性非特异性炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn disease，CD)［1-2］。近年来，炎症性肠病在亚洲的发病率显著升高，但其发病机制尚未明确，目前认为IBD 是一种复杂的多基因疾病，遗传易感性在其发病中起着重要作用;然而，在目前研究发现的众多与IBD 发病、临床特征、药物疗效相关的基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)中，大部分SNP 与欧美IBD 相关，而与我国IBD 不相关，因此需要进一步研究影响我国IBD 人群的基因位点。

宿主对菌群抗原刺激产生的异常免疫反应被认为是IBD 重要的发病机制［3-4］。杀菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)是参与到宿主识别菌群抗原过程的重要因子，它能够竞争性结合革兰阴性(G-)菌的主要抗原脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，从而非特异性杀伤G-菌［5］，中和LPS;同时，BPI 能够抑制LPS 与Toll 样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)等结合形成复合物，进而减弱该复合物激活的一系列免疫炎症反应［6-8］，见图1。因此，BPI 很可能参与到IBD 发病中。国外多项研究显示BPI 为IBD 易感基因，其单核苷酸多态性Glu216Lys (即rs4358188 或c. 645 G ＞A)与新西兰、德国、土耳其等人群的IBD 发病和临床特征相关［9-11］，该位点G 替换为A 能导致谷氨酸变为赖氨酸，可能导致BPI 结合LPS 结构发生变化，从而可能影响BPI 清除细菌、抑制炎症的功能;此外，国内研究者运用基因芯片技术从全基因组大规模筛选IBD易感基因后，发现BPI 基因在UC 患者外周血单核细胞中较正常人表达上调［12］。因此，BPI 很可能是中国人群的IBD 易感基因，而关于BPI Glu216Lys 与我国人群IBD 的关系尚未见报道，本研究将探讨Glu216Lys 与我国人群IBD 易感性的关系及其对不同临床特征的影响。

Figure 1. Bacterial antigen recognition pathway. CARD15/NOD2 could respond to the bacteria component muramyl dipeptide(MDP)［5］. LBP could bind to extracellular antigen LPS，then LBP-LPS complex is presented to the recognition receptor TLR4 expressed in membranes of epithelial cells and monocytes by CD14. Finally，CARD15/NOD2-MDP or LPS-TLR4 complex will activate the intracellular signaling pathways which lead to activation of the transcription factor，nuclear factorκB (NF-κB)，and then induce the expression of a variety of host defense genes and stimulate the innate immune response［6-8］. However，the BPI protein can effectively compete with LBP for binding to LPS and the BPI-LPS complex does not provoke subsequent immune response.图1 细菌抗原识别通路

材 料 和 方 法

1 研究对象

研究对象为我院2003 年～2011 年IBD 门诊及住院确诊的286 例IBD 患者(包括CD 173 例，UC 113 例)，以及同期332 名在我院接受健康体检的性别、年龄匹配的健康人。IBD 的诊断标准参考2007年中华医学会消化病学分会推荐标准［13］，即根据临床表现、小肠钡剂造影检查、结肠镜检查、双气囊小肠镜/胶囊内镜和黏膜活检作出临床诊断，确诊病例为经病情观察符合CD/UC 病程经过或通过手术取得病理诊断者。IBD 的临床分型采用蒙特利尔分型标准［14］。临床资料通过查阅我科IBD 数据库获得，主要收集患者的人口学资料及临床分型特征，包括性别、发病年龄、症状、吸烟史、家族史、肠外表现、肛周病变、临床特征等资料。本研究已经中山大学附属第一医院临床研究伦理委员会批准，标本采集获得研究对象的知情同意。

2 方法

2.1 基因组DNA 提取 分别采集病例及健康对照2 mL 外周血，采用天根血液基因组织DNA 提取试剂盒(北京天根有限公司提供)提取基因组DNA。具体操作步骤参见试剂盒说明书。

2.2 BPI Glu216Lys 基因分型 采用引物介导的限制性分析PCR(primer-introduced restriction analysis PCR，PIRA-PCR)方法。上游引物5’-CACTATGGGAAGACCTTACTGATTAC-3’，下 游 引 物 5’-CAGAGTCTGGAAATAAGGTTGAAGC-3’，在下游引物中引入1 个A 碱基(下划线处)，用于构建内切酶Hind III 的限制性切点。PCR 反应条件:95 ℃预变性3 min;95 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃30 s，35 个循环;72 ℃10 min，冷却至4 ℃保存。PCR 产物以限制性内切酶Hind III (New England Biolabs)于37 ℃酶切2 h，再于65 ℃20 min 使酶失活。用含溴化乙啶的4%琼脂糖凝胶电泳。

基因型判定:PCR 产物为104 bp，在Hind III 内切酶作用下，A 等位基因可被切成78 和26 bp 2 个片段(26 bp 的片段过小，难以检测);G 等位基因则不能被切开，电泳显示104 bp 的条带，见图2。抽样测序结果与电泳结果一致。

Figure 2. Glu216Lys mutation analysis with restriction enzyme Hind III.M:marker.图2 Glu216Lys 位点Hind III 酶切电泳图

3 统计学处理

应用SPSS 13.0 统计软件行统计学分析。根据Hardy-Weinberg 遗传平衡定律，采用χ2检验分析对照组样本的群体代表性。病例组与对照组间Glu216Lys 基因型分布频率的比较采用Pearson-χ2检验;基因型与IBD 临床特征间关系采用单因素和Logistic 回归分析，计算优势比(odds ratio，OR)及其95%置信区间(confidence interval，CI)，其中OR 值经性别和年龄校正。数据以均数±标准差(mean ±SD)表示。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 一般情况

病例组纳入的286 名IBD 病人中，男178(62.2%)例，女108(37.8%)例，平均年龄(33.5 ±13.1)岁，见表1;正常对照中，男197 例(59.3%)，女135 例(40.7%)，平均年龄(32.0 ±8.2)岁;2 组间性别构成比和年龄均无明显差异(均P ＞0.05)。对照组Glu216Lys 基因型分布频率符合Hardy-Weinberg平衡(P ＞0.05)，具有群体代表性。

表1 炎症性肠病病人基本资料Table 1. Demographic characteristics of IBD patients

2 BPI Glu216Lys 基因型在炎症性肠病及对照人群中频率分布

CD 和UC 病人中，分别检测出GG 基因型95(54.9%)和 69 (61.1%)例，GA 基 因 型 68(39.4%)和38(33.6%)例，AA 基因型10 (5.7%)和6 (5.3%)例;对照人群中，GG 基因型206(62.1%)例，GA 基因型115(34.6%)例，AA 基因型11(3.3%)例;无论是CD 还是UC 病人，Glu216Lys基因型频率及等位基因频率均与对照组无明显差异(P ＞0.05)，见表2。

表2 Glu216Lys 基因型在正常对照及病例中分布情况Table 2. Allelic and genotypic frequencies of the Glu216Lys polymorphism in IBD patients and controls

3 BPI Glu216Lys 基因型与IBD 临床特征的关系

根据不同临床特征对CD 和UC 患者进行分层，分析Glu216Lys 基因型与疾病各类临床特征的相关性。单因素分析方法结果显示该基因型与UC/CD各临床特征不相关(P ＞0.05)，为排除混杂因素影响，进一步采用多因素分析方法，经年龄、性别等因素校正后，结果仍显示该基因型与CD 或UC 的临床特征无关(P ＞0.05)，见表3、4。

表3 Glu216Lys 基因型与CD 临床特征的相关性Table 3. Association between Glu216Lys genotypes and CD clinical characteristics

表4 Glu216Lys 基因型与UC 临床特征相关性Table 4. Association between Glu216Lys genotypes and UC clinical characteristics

讨 论

BPI 是先天免疫系统中抵御革兰阴性杆菌的重要因子，它对LPS 具有高亲和力，能与G-菌表面LPS 及游离LPS 结合，进而促进菌体裂解、中和内毒素以及促进补体活化、增强调理吞噬等。BPI 在多形核细胞中表达丰富，也广泛地表达于肠道等人体黏膜上皮细胞中［15］。国外研究报道了BPI 在IBD 患者黏膜中表达升高［16］，我国研究［13］发现BPI mRNA在UC 患者中的相对表达量明显高于正常对照组(P＜0.05)，国内外研究也发现BPI 是IBD 患者体内抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)的主要靶抗原之一［17］，并且BPI 自身抗体在IBD 中呈高表达，它能增强IBD 病人局部和全身炎症，延长炎症持续时间［18］;故这些预示BPI 可能在IBD 中起着重要作用。BPI Glu216Lys 可以导致一个氨基酸改变，这可能最终影响BPI 蛋白抵御革兰阴性菌的功能，此外，该位点多态性可能改变被核周型ANCA 识别的BPI 蛋白结构，从而参与IBD 疾病过程;BPI 单核苷酸多态性位点Glu216Lys 已被证实与多国人群IBD 易感性有关［9-11］，因此，本文研究了BPI Glu216Lys 是否与中国人IBD 发病及临床特征相关。

我们的研究结果显示BPI Glu216Lys 与中国人群CD 或UC 的发病无明显相关性，进一步分析亦未发现其与疾病临床特征相关。BPI Glu216Lys 的GG基因型频率在德国CD 患者中相对于正常对照人群明显下降(P ＜0.05)［10］，而在新西兰人群中，该SNP的A 等位基因与回结肠型CD 相关(P ＜0.01，OR=1.16，95%CI:1.14 ～2.27)［9］;此外来自土耳其的研究［11］表明它与UC 和CD 发病均相关(P ＜0.01)，并且GG 基因型在激素依赖患者中表达明显下降(P ＜0.05，OR =0.75，95%CI:0.66 ～0.86)。与这些国家人群相比，我们发现中国人群中野生型纯合子GG基因型频率显著增高，而突变型纯合子AA 频率显著下降(P ＜0.05)，见图3，这进一步证实不同人群存在显著的遗传差异，因此我们的研究结果与这些种族人群的不同，一方面可能是我们的样本量较小，未能发现两者的联系;另一方面，BPI 很可能与其它参与细菌识别过程的IBD 易感基因如NOD2/CARD15等相似［8］，是白种人的IBD 易感基因，而非中国人群的IBD 易感基因。

Figure 3. Frequency analysis of Glu216Lys genotypes in general population among different races. 1:Chinese population;2:Turkey population;3:Germany population;4:New Zealand population. ＊＊P ＜0.01 vs group 1.图3 不同种族的正常人群中Glu216Lys 基因型分布频率

综上所述，本研究表明BPI Glu216Lys 位点与我国汉族人群IBD 易感性无明显相关性，但不能排除该位点与其它基因位点的相互作用或BPI 基因的其它SNP 位点与我国汉族人群IBD 相关。BPI 基因与中国人群IBD 易感性关系仍需要进一步大样本多位点研究，并进行关联分析和单倍体型分析等，以进一步明确该基因多态性在IBD 中的作用。

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