Caveolae 在高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞细胞外基质合成中的作用*

卢圣霞， 刘元涛， 孔 峰， 杜月娟， 刘 晔， 傅余芹△

(山东大学第二医院1肾脏内科，2内分泌科，3中心实验室 山东 济南250033;4济南市中心医院肾脏内科，山东 济南250013)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的微血管并发症之一，以肾小球细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积为其显著的病理特点，成为导致终末期肾病最主要的原因［1-2］。高血糖是导致DN 发病的一个主要因素，它通过激活多条信号通路，上调纤维连接蛋白(fibronectin，FN)及I型胶原(collagen type I，Col I)的表达，最终导致ECM积聚［3-4］。Caveolae 是近年来发现的一种富含胆固醇(cholesterol，Chol)及磷脂的胞膜小凹结构，caveolin是其标志性结构蛋白，广泛存在于血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞及上皮细胞等多种细胞的细胞膜上。研究表明，caveolae 为多种信号分子提供了一个聚集的场所，对于细胞增殖、分化、凋亡等多种功能具有重要调控作用［5-6］。肾小球系膜细胞(mesangial cells，MCs)是一种类平滑肌样细胞，其细胞膜含有caveolae［6］。既往研究发现，caveolae 在转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)诱导的内皮细胞ECM 分泌过程中具有重要作用［7］，而高糖环境下caveolae 在肾小球系膜细胞ECM 合成中的作用目前尚不明确。本研究旨在探讨caveolae 在高糖诱导的肾小球系膜细胞ECM 合成中的作用与机制。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠肾小球系膜细胞(由山东大学医学院易凡教授惠赠);DMEM 培养基和新生胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)均购自Gibco;小凹蛋白1(caveolin-1，Cav-1)抗体购自BD;磷酸化的小凹蛋白1(phosphorylated caveolin-1 on tyrosine 14，p-Cav-1-Y14)抗体购自CST;Col I 抗体购自Abcam;β-actin 抗体、辣根过氧化物酶标记的兔Ⅱ抗和鼠Ⅱ抗均购自北京中杉金桥公司;FN ELISA 试剂盒购自RD。Real-time PCR Ultra SYBR mixture 试剂盒购自大连宝生物工程总公司;RIPA、PMSF 和BCA 试剂盒均购自江苏碧云天生物技术研究所。

2 方法

2.1 大鼠肾小球系膜细胞培养 MCs 以(0.5 ～1)×106接种于DMEM 完全培养基中(含10%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺)，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，2 ～3 d 换液，待细胞长至90% 培养皿时用0.25%胰蛋白酶消化传代。

2.2 细胞分组及处理 培养细胞待其贴壁融合70% ～80%后用无血清低糖DMEM 培养基同步化24 h，根据实验设计进行如下分组及处理:(1)正常糖(normal glucose，NG)组(5.5 mmol/L 葡萄糖+24.5 mmol/L 甘露醇);(2)高糖(high glucose，HG)HG 组(30 mmol/L 葡萄糖);各组继续培养细胞0、12、24 和48 h。为观察高糖诱导Cav-1 磷酸化的剂量效应，不同浓度的葡萄糖(5.5、16.7 和30.0 mmol/L)分别处理细胞1 h，各组渗透压均用甘露醇调整至30.0 mmol/L 以避免渗透压不同对实验结果造成的干扰(5.5 mmol/L 葡萄糖+24.5 mmol/L 甘露醇;16.7 mmol/L 葡萄糖+13.3 mmol/L 甘露醇)。为观察高糖诱导Cav-1 磷酸化的时间效应，选取作用效果最明显的30.0 mmol/L 葡萄糖短时处理细胞0～4 h。同步化的细胞经甲基-β-环糊精(methyl-βcyclodextrin，β-MCD;5 mmol/L)预处理1 h 后再分为2 组:β-MCD+HG 组(5 mmol/L β-MCD + 30 mmol/L 葡萄糖);β-MCD+HG+Chol 组(5 mmol/L β-MCD+ 30 mmol/L 葡萄糖+ 15 mg /L Chol)，各组继续培养细胞1、12、24 和48 h，按照各处理组指定时间收集细胞及上清，进行分析。

2.3 实时定量PCR 以TRIzol 抽提处理后的细胞总RNA，逆转录为cDNA，采用SYBR Green 嵌合荧光进行实时定量PCR，反应体系25 μL，上、下游引物均由大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)设计合成(表1)，反应条件如下:预变性:95 ℃，30 s;95 ℃，5 s;55℃～60 ℃，34 s;同时获取荧光，共40 个循环，每组重复6 次，反应结束后行产物的熔解曲线分析，以GAPDH 为内参照进行结果分析。

表1 实时定量PCR 的引物序列Table 1. Real-time PCR primer sequences

2.4 ELISA 法检测细胞上清液中FN 蛋白含量 取不同处理因素作用0、12、24 和48 h 的细胞上清液，6 000 r/min 4 ℃离心10 min，收集上清，每组重复3次，后续操作按ELISA 试剂盒说明书进行，在酶标仪450 nm 波长处，以空白对照孔调零，直接测定其吸光度(A)，并由标准曲线公式换算成各蛋白的浓度值。

2.5 Western blotting 细胞处理不同时点后，弃去培养基，用预冷PBS 洗3 遍，加入细胞裂解液，提取细胞蛋白。BCA 法检测蛋白浓度。等量细胞蛋白(60 μg)加5 ×loading buffer 煮沸变性10 min，10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至NC 膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，Ⅰ抗［Cav-1(1 ∶2 000);p-Cav-1-Y14(1∶1 000);Col I(1∶1 000);β-actin (1∶1 000)］4 ℃孵育过夜，NC 膜用TBST 缓冲液洗3 遍后，再与辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗室温孵育1 h 后显影。免疫复合物用ECL 方法检测，电泳条带用ImageJ 软件分析灰度值。

3 统计学处理

使用SPSS 17.0 软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差(mean ±SD)表示，组间比较及显著性检验采用One-way ANOVA 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 高糖对系膜细胞FN 和Col I 蛋白表达的影响

与NG 组相比，高糖培养24 h 细胞FN 浓度显著增加(P ＜0.05)，48 h 达到高峰，见图1。与HG 0 h组相比，高糖培养12 h 细胞Col I 蛋白表达明显增多(P ＜0.05)，48 h 达到高峰，见图2。

Figure 1. Quantitative analysis of the FN level induced by high glucose (30 mmol/L). Mean ±SD. n =3. * P ＜0.05 vs NG group.图1 高糖(30 mmol/L)对系膜细胞FN 蛋白水平的定量分析

Figure 2. The effect of high glucose (30 mmol/L)on expression of Cav-1 and Col I. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05 vs HG 0 h group.图2 高糖(30 mmol/L)对系膜细胞Col I 和Cav-1 蛋白表达的影响

2 高糖对系膜细胞Cav-1 mRNA 及蛋白表达的影响

高糖处理系膜细胞，各时点Cav-1 mRNA 及蛋白表达量较HG 0 h 组差异均无统计学意义(均P ＞0.05)，见图2、3。

Figure 3. The effect of high glucose (30 mmol/L)on Cav-1 mRNA expression.Mean±SD.n=3.图3 高糖(30 mmol/L)对系膜细胞Cav-1 mRNA 表达的影响

3 高糖对肾小球系膜细胞Cav-1 磷酸化水平的影响

以p-Cav-1-Y14 与Cav-1 灰度比值作为Cav-1 磷酸化水平的指标进行定量分析，结果显示:不同浓度(5.5、16.7 和30 mmol/L)葡萄糖处理MCs，Cav-1 磷酸化水平呈现浓度依赖性升高(P ＜0.01)，见图4;30 mmol/L 高糖处理后，Cav-1 磷酸化水平于0.5 h即可出现升高，1 h 达到高峰，之后磷酸化水平逐渐下降(P ＜0.01)，见图5。

4 甲基-β-环糊精及胆固醇对肾小球系膜细胞Cav-1 磷酸化水平的影响

与单纯HG(30 mmol/L)组相比，β-MCD(预处理1 h)+HG(30 mmol/L，1 h)组Cav-1 磷酸化水平明显下降(P ＜0.01);而β-MCD + HG + Chol(15 mg/L)组Cav-1 磷酸化水平较β-MCD +HG 组显著升高(P ＜0.01)，见图6。

Figure 4. Phosphorylation of Cav-1 induced by high glucose at different concentrations.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs NG (5.5 mmol/L)group;##P ＜0.01 vs HG (16.7 mmol/L)group.图4 高糖诱导Cav-1 磷酸化的剂量效应

Figure 5. Phosphorylation of Cav-1 induced by high glucose(30 mmol/L)at different time points. Mean ± SD. n =3.＊＊P ＜0.01 vs HG 0 h group.图5 高糖(30 mmol/L)诱导Cav-1 磷酸化的时间效应

Figure 6. Effects of β-MCD(5 mmol/L)and cholesterol(15 mg/L)on phosphorylation of Cav-1.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs NG group;##P ＜0.01 vs HG group;△△P ＜0.01 vs HG+β-MCD group.图6 甲基-β-环糊精(5 mmol/L)及胆固醇(15 mg/L)对系膜细胞Cav-1 磷酸化的影响

5 甲基-β-MCD 及胆固醇对细胞FN 及Col-1 蛋白表达的影响

与单纯HG 组相比，HG +β-MCD 组各时点FN的浓度均显著降低(均P ＜0.05)，见图7;与HG+β-MCD 组相比，HG+β-MCD+ Chol 组各时点FN 浓度均明显升高(均P ＜0.05)，见图7。各时点Col-1 蛋白表达量在HG、HG + β-MCD 及HG + β-MCD +Chol 组差异无统计学意义(均P ＞0.05)，图8 为各组处理细胞48 h 后的结果。

讨 论

Caveolae 是具有烧瓶底型凹陷形态的特殊脂筏结构，广泛存在于血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞及上皮细胞等多种细胞的细胞膜上［6］。在肾脏，caveolae 主要存在于肾小球血管内皮细胞及系膜细胞［5-6］。Cav-1 是caveolae 的标志性蛋白，对维持caveolae 结构和功能的完整起关键作用［8］。目前已知，caveolae 参与细胞分化、增殖、肿瘤、炎症、衰老等多种病理生理过程，对疾病的发生、发展及转归有重要的意义［9］。既往研究发现，糖尿病大鼠肾小球血管内皮细胞Cav-1 表达明显升高，而Cav-1 表达升高可抑制eNOS 活性，使NO 合成减少［10］，这可能是糖尿病肾病的重要发病机制之一。至于糖尿病状态下，肾小球系膜细胞Cav-1 表达的变化及其在糖尿病肾病中的病理意义目前尚不清楚。本研究发现，高糖培养的大鼠系膜细胞FN 和Col I mRNA 及蛋白水平明显升高，这与既往的研究结果一致［11］。为探讨caveolae在高糖诱导的系膜细胞ECM合成中的作用，我们观察了高糖对Cav-1 表达的影响，结果显示高糖对Cav-1 的mRNA 及蛋白表达无明显影响。

Figure 8. The effect of β-MCD (5 mmol/L)and cholesterol (15 mg/L)on Col I expression. Mean ±SD. n =3. * P ＜0.05 vs NG group.图8 甲基-β-环糊精(5 mmol/L)及胆固醇(15 mg/L)对系膜细胞Col-1 表达的影响

最初，Cav-1 是以其酪氨酸磷酸化的形式，作为Src 激酶的磷酸化底物被首次发现［12］。业已证实，位于Cav-1 的N 末端酪氨酸14 位点是其主要磷酸化位点［13］。除Src 之外，多种细胞因子(如血小板衍生因子、上皮生长因子、胰岛素等)也能够引起该位点的磷酸化。p-Cav-1-Y14 被认为是Cav-1 的活化形式，可与多种信号蛋白交联，实现信号的跨膜转导［14-15］。本研究发现，高糖状态下Cav-1 蛋白表达虽无变化，但其磷酸化水平显著升高，且与FN 表达密切相关。

Caveolae 结构中富含胆固醇，而胆固醇对维持caveolae 结构和功能是必需的。β-MCD 是一种细胞外胆固醇受体，对胆固醇有很高的亲和力，可以去除胞膜中的胆固醇，特异性干扰caveolae 形成而不对胞膜的完整性造成影响［16-17］。本实验发现，β-MCD 预处理可显著抑制高糖诱导的Cav-1 磷酸化，同时导致FN 合成减少，但对高糖诱导的Col I 表达无显著影响。以上结果提示，高糖诱导的Cav-1 磷酸化有赖于caveolae 结构的完整，而磷酸化的Cav-1 可能介导了高糖诱导的FN 合成，但对高糖诱导的Col I 合成无介导作用。以上结果提示高糖通过多种信号途径对不同细胞外基质的合成进行调控。

总之，本研究结果提示caveolae 及其结构蛋白Cav-1 在高糖诱导的肾小球系膜细胞FN 的合成过程中具有重要调节作用。关于高糖状态下Cav-1 磷酸化的发生机制以及磷酸化的Cav-1 如何调节FN 合成尚待进一步研究。

［1］ 周 群，宋菊敏，陈卫星，等.糖尿病性微血管病的临床病理生理［J］. 中国病理生理杂志，2007，23(2):399-402.

［2］ 方华伟，傅玉芹，韩亚丽，等.组织蛋白酶B 和胱抑素C在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达及意义［J］.中国病理生理杂志，2009，25(7):1399-1403.

［3］ Hayashi K，Wakino S，Kanda T，et al. Molecular mechanisms and therapeutic strategies of chronic renal injury:role of Rho-kinase in the development of renal injury［J］.Pharmacol Sci，2006，100(1):29-33.

［4］ Zeng L，Xu H，Chew TL，et al.HMG CoA reductase inhibition modulates VEGF-induced endothelial cell hyperpermeability by preventing RhoA activation and myosin regulatory light chain phosphorylation［J］. FASEB J，2005，19(13):1845-1847.

［5］ Percy CJ，Pat BK，Healy H，et al.Phosphorylation of caveolin-1 is anti-apoptotic and promotes cell attachment during oxidative stress of kidney cells［J］. Pathology，2008，40(7):694-701.

［6］ Tamai O，Oka N，Kikuchi T，et al. Caveolae in mesangial cells and caveolin expression in mesangial proliferative glomerulonephritis［J］.Kidney Int，2001，59(2):471-480.

［7］ Wang XM，Zhang Y，Kim HP，et al. Caveolin-1:a critical regulator of lung fibrosis in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.J Exp Med，2006，203(13):2895-2906.

［8］ Couet J，Li S，Okamoto T，et al. Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain.Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins［J］. J Biol Chem，1997，272(10):6525-6533.

［9］ Schwencke C，Braun-Dullaeus RC，Wunderlish C，et al.caveolae and caveolin in transmembrane signaling:implications for human disease［J］. Cardiovasc Res，2006，70(1):42-49.

［10］Chen Z，Bakhshi FR，Shajahan AN，et al. Nitric oxide-dependent Src activation and resultant caveolin-1 phosphorylation promote eNOS/caveolin-1 binding and eNOS inhibition［J］.Mol Biol Cell，2012，23(7):1388-1398.

［11］Marks JB，Raskin P.Nephropathy and hypertension in diabetes［J］.Med Clin North Am，1998，82(4):877-907.

［12］Bharat J，Michele B，Scott SS，et al.Phosphocaveolin-1 is a mechanotransducer that induces caveola biogenesis via Egr1 transcriptional regulation［J］.J Cell Biol，2012，199(3):425-435.

［13］Li S，Seitz R，Lisanti MP.Phosphorylation of caveolin by Src tyrosine kinases:the α-isoform of caveolin is selectively phosphorylated by v-Src in vivo［J］. J Biol Chem，1996，271(7):3863-3868.

［14］Sargiacomo M，Sudol M，Tang ZL，et al. Signal transducing molecules and glycosylphosphatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells［J］.J Cell Biol，1994，126(1):111-126.

［15］Lisanti MP，Scherer PE，Vidugiriene J，et al. Characterization of caveolin-rich membrane domains isolated from an endothelial-rich source:implications for human disease［J］.J Cell Biol，1994，126(1):111-126.

［16］Chintagari NR，Jin N，Wang P，et al.Effect of cholesterol depletion on exocytosis of alveolar typeⅡcells［J］. Am J Respir Cell Mol Biol，2006，34(6):677-687.

［17］蕈 丽，廖端芳.Caveolae/caveolin-1 与细胞胆固醇转运［J］.中国病理生理杂志，2007，10(4):2067-2070.