骨关节炎患者膝关节软骨和滑膜中p38MAPK、NF-κB的表达及其意义

郭 静 勾向博 张文丽 李琪佳 王志强

(河北联合大学医学实验研究中心，①基础医学院药理学教研室，②附属医院骨科 河北唐山 063000)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种以关节疼痛、肿胀、畸形和功能障碍为主要临床表现，由多种因素引起的多发于老年人的慢性退行性骨关节疾病，以缓慢进行性的关节软骨破坏为主要病理特征，好发于负重较大的膝关节、髋关节、脊柱及手指等部位，其中膝关节OA是老年人群中最常见的关节炎类型，也是导致老年人疼痛和残疾的首要病因。国外学者多项研究表明:p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)与核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号转导途径在OA的发病过程中起着重要作用，OA时由软骨和滑膜分泌的大量炎性细胞因子IL-1、TNF-α等可以通过p38MAPK、NF-κB信号转导途径的激活而诱导炎性介质如iNOS、COX-2 及 MMP-1、MMP-9、MMP-13 等金属蛋白酶的基因表达［1］。p38可分为激活状态和非激活状态，一般情况下在同种组织中p38的总蛋白含量相对保守，而它的激活状态的增加也即P-p38的含量增加代表了p38MAPK信号转导途径被激活。NF-κB家族成员之间可形成一系列同源或异源二聚体，典型的NF-κB是由p65和p50两个亚基组成。本研究通过观察膝关节OA软骨与滑膜组织中P-p38、NF-κB p65蛋白的表达及分布特点，了解二者在OA发生发展中的作用及相互关系，为OA发病机制和治疗研究奠定理论基础。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选取唐山市骨科医院行人工全膝关节置换术60例OA患者自愿捐赠的软骨与滑膜标本作为实验组，其中男24例，女36例，平均(66．3±8．4)岁;另取20例因交叉韧带断裂、盘状软骨损伤等行手术治疗的患者自愿捐赠的软骨与滑膜标本，男16例，女4例，平均(32．8±7．6)岁，经病理学诊断膝关节无病变，作为正常对照组。全部新鲜标本术后1h内均用生理盐水冲洗，切成1．0cm×0．8cm×0．5cm小块，以10%中性甲醛固定48h，关节软骨以10%EDTA脱钙6、7周，每周更换脱钙液1次，脱钙满意后常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，以4～5μm厚度连续切片，备份HE及免疫组织化学染色。

1．2 方法 P-p38多克隆抗体浓缩液、NF-κB p65多克隆抗体浓缩液购自武汉博士德公司，即用型Elivision免疫组化两步法检测试剂盒、棕黄色DAB显色试剂盒购自福州迈新公司，参照试剂说明书进行免疫组化染色。

1．3 判定标准 采用CMIAS真彩色医学图象分析系统对各组免疫组化结果进行积分光密度(integral optical density，IOD)值检测及分析。每张切片随机选取5个高倍视野(×200)，每个视野中选择1个具有代表的阳性细胞中棕黄色颗粒进行标记，以此标准自动检测所有视野的阳性细胞，以参数平均IOD值代表蛋白的颗粒密度。并计算每个高倍视野的阳性细胞数和细胞总数，按其阳性细胞分布范围计算百分率:阳性细胞数占细胞总数的比例小于5%计为(-)，阳性细胞占5% ～25%为(+);阳性细胞占25% ～50%为(■);阳性细胞占50%以上为(■)。

1．4 统计学处理 采用SPSS 13．0统计分析软件进行统计学处理。计数资料采用χ2检验，计量资料用表示，组间均数的比较用t检验;将实验组P-p38、NF-κB p65蛋白表达的IOD值进行Pearson直线相关分析。以P＜0．05确定为差别有统计学意义。

2 结果

2．1 P-p38 实验组软骨细胞、滑膜细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等胞核均有P-p38表达，其中软骨中尤以固缩变性的软骨细胞为重，在滑膜主要分布于衬里层的巨噬细胞样细胞、成纤维细胞样细胞及淋巴细胞胞核内。对照组仅在软骨表层及滑膜衬里层细胞有少量表达，但染色强度较低。图像分析显示，实验组P-p38蛋白表达的IOD值为(11．35±3．39)，高于对照组的(3．28 ±1．19)(P＜0．01)。两组 P-p38 蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义(P＜0．01)，见表1。

2．2 NF-κB 实验组各层软骨细胞、增生的滑膜衬里层细胞及衬里下层的血管内皮细胞、成纤维细胞、浸润的炎细胞的胞质和胞核内均可见大量的NF-κB强阳性表达，其中以胞核着色为主，多呈团块状分布。对照组软骨与滑膜的阳性细胞分布与实验组相似，但表达较少，且以胞质着色为主。图像分析显示，实验组NF-κB p65蛋白表达的 IOD值为(11．86±3．15)，高于对照组的(3．72±1．06)(P＜0．01)。两组 NF-κB p65 蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义(P＜0．01)，见表1。

表1 P-p38、NF-κB 在实验组与对照组中阳性表达率的比较(%)

2．3 实验组P-p38与NF-κB表达的关系 相关分析显示，实验组P-p38蛋白与NF-κB蛋白表达成正相关(r=0．426，P＜0．01)。

3 讨论

OA的病因学主要表现在两个方面:一是关节软骨破坏导致软骨细胞生物学特性改变，使软骨细胞释放多种酶类、细胞因子及生长因子;二是OA中关节软骨在致病因素作用下被破坏后，释放碎片进入滑液，刺激滑膜引起滑膜炎症反应，致使滑膜细胞释放炎症介质，进一步降解软骨，周而复始造成恶性循环。

p38MAPK信号转导通路属于MAPK家族中的应激活化蛋白激酶，是一种分布于胞浆中具有丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化能力的蛋白激酶，其信号转导途径是细胞外信号引起核内反应的通道之一。p38静息状态主要分布于细胞浆，可被多种刺激因子激活，激活后转移至细胞核内调节效应基因的表达，在细胞免疫、炎症反应及细胞凋亡等过程中发挥作用［2］。Joos等［3］人研究发现，多种p38MAPK抑制剂均能够显著地抑制IL-1β诱导的人OA软骨细胞中COX-2、iNOS、MMP-13及PGE2等炎性介质的基因表达。膝OA模型大鼠的研究同样证明了关节软骨中p38MAPK被激活，并且其抑制剂SB203580能够明显地降低软骨细胞凋亡与Ⅱ型胶原的降解以及抑制MMP-3、MMP-13的表达，对关节软骨具有保护作用，延缓OA进程。表明p38MAPK信号途径在OA的病程中起着重要作用［4］。又有研究表明，NO可以通过激活p38MAPK诱导兔关节软骨细胞凋亡［5］;膝关节OA患者的软骨细胞体外培养中，发现由Fas途径介导的软骨细胞凋亡同样依赖于p38MAPK的活性［6］。因为NO途径和Fas途径是介导软骨细胞凋亡的两个最重要的途径，因此推测p38MAPK信号途径的激活与OA软骨细胞凋亡也有密切的关系。本实验应用免疫组化检测发现，OA组P-p38蛋白阳性表达率显著高于对照组;两组中P-p38蛋白表达IOD值分别为(11．35 ±3．39)和(3．28 ±1．19)，与对照组相比，OA组软骨与滑膜组织中P-p38表达明显增强，差异有统计学意义(P＜0．01)。并且，我们发现P-p38蛋白在OA软骨基质纤维化严重区域内退变的软骨细胞胞核内呈强烈表达。结合本研究数据认为，p38MAPK信号转导途径在人膝关节OA软骨和滑膜组织中被激活，可能促进OA软骨的进行性破坏。

NF-κB是由Sen等在1986年首先应用凝胶电泳迁移率多肽实验发现了B细胞核提取物中一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异结合的蛋白因子，称之为NF-κB。正常情况下常与其抑制性蛋白(IκB)结合而呈非活性状态。可被TNF-α、IL-1、蛋白激酶C激活剂、氧化剂、自由基等多种刺激因素激活，激活的NF-κB与其抑制性蛋白解离，从胞浆转位进入胞核，与DNA上靶基因上游的启动子/增强子上的κB位点结合，调节靶基因的表达［7］。Csaki等［8］研究表明，白藜芦醇和姜黄素对人关节软骨的协同保护作用是通过抑制IL-1β诱导的NF-κB信号通路活化介导的炎症反应与细胞凋亡。Isabel等［9］研究发现，OA患者滑膜组织中过度表达的高迁移率族蛋白B1能够作为炎性细胞因子而加强OA滑膜的炎性过程;并且可以与IL-1β协同刺激滑膜细胞p38MAPK、NF-κB等信号通路活化，诱导滑膜细胞产生大量的细胞因子、趋化因子及基质金属蛋白酶，导致OA关节软骨进行性损坏。本实验结果显示，OA组关节软骨和滑膜中NF-κB蛋白表达与对照组比较，差异有统计学意义。NF-κB阳性细胞弥漫性分布于各层软骨细胞、增生的滑膜衬里层细胞以及衬里下层的血管内皮细胞、成纤维细胞、浸润的炎细胞等。因此本实验证明:人膝关节OA软骨和滑膜中NF-κB信号转导途径同样是被激活的。

本研究相关分析显示，OA组P-p38与NF-κB蛋白表达之间存在明显的正相关，提示P-p38的增加可能进一步引起NF-κB的表达增加，NF-κB作为一种转录因子，有可能被p38MAPK激活，但仍需进一步研究加以证实。同时这一实验结果也表明，p38MAPK与NF-κB信号通路之间可能存在着串话。

综上所述，p38MAPK与NF-κB信号通路在OA关节软骨和滑膜组织中被高度激活并呈明显正相关，二者在OA的发生及发展过程中具有重要作用。然而，OA的病理发展是一个复杂的并受多种信号通路影响的过程，它不受任一信号通路(包括p38MAPK和NF-κB)单独调节。在任何时候关节软骨和滑膜细胞内都有大量信号通路的激活，各信号通路之间的相互串话、正负反馈循环以及大量信号整合的结果决定软骨细胞最后的反应(包括软骨细胞的合成代谢、分解代谢、细胞增殖、细胞凋亡等)。因此，对p38MAPK与NF-κB信号通路和OA的相关性进行深入探讨，可以为解释OA的发病机制及病理过程提供帮助，并且为OA的治疗提供新的靶点和策略。

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