龟贞地黄饮对性早熟大鼠性腺发育的影响

孙丽英，于秋爽，胡晓阳，陈宝忠，马育轩，高微，秦鹏飞，张亮

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

性早熟是由于儿童发育提前以致各激素水平升高，性激素的分泌增加，致使第二性征过早的出现。目前认为，女子在8岁前第二性征发育或9岁前月经来潮，男子在9岁前开始性发育，即可诊断为性早熟［1］。

正常青春期启动和性早熟发生时，卵巢黄体出现率、大鼠的卵巢指数、子宫指数均会增大，子宫壁增厚。卵巢黄体的出现是卵巢发生排卵的直接证据，是卵巢、子宫功能活动的证据，故可以通过观察雌鼠的卵巢、子宫等性器官的组织学检查，借以判定大鼠的性早熟情况。

1 实验材料

1．1 实验动物

取60只清洁级雌性SD大鼠，喂养24日龄时断奶，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK20080001(黑)。正常喂食饲料和自由饮水。在通风、温度、湿度适宜的动物室内，常规、适应性饲养1周。

1．2 实验药物

龟贞地黄饮:熟地黄24g，龟板12g，山药12g，山茱萸12g，女贞子12g，茯苓、泽泻、牡丹皮各9g，知母6g，由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室提供。

1．3 实验仪器

移液器(Gilson公司);光学显微镜(日本OLYMPUS公司生产);AL204 电子天平［梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司］;台式离心机(德国EPPENDORF公司);电热恒温水浴锅(北京长风仪器仪表厂)。

2 实验方法

2．1 溶液配制 NMA:40mg/kg，溶于0．2ml生理盐水中;中药高剂量，30ml/kg;中药中剂量，15ml/kg;中药低剂量组，7．5ml/kg。

2．2 模型制备、分组方法、给药方法

参照前期研究结果［1，2］。

2．3 取材方法

经阴道涂片检查，在确定出现了第一个动情前期时，将该模型组大鼠处死，其余各组按1:1 比例同时用颈椎脱臼法处死大鼠。马上开腹，取出双侧卵巢和子宫，用电子天平称量卵巢和子宫的湿重后，将卵巢放入10%甲醛溶液中固定，4℃保存，以备组织病理学检查。

3 观察指标及测定方法

3．1 阴道细胞涂片

将消毒的细棉签(自制棉签)用生理盐水湿润，轻轻插入大鼠阴道内，慢慢转动两下取出，把带有阴道内含物的棉签在载玻片上均匀转动做成涂片，酒精灯烘干后，用碱性美兰溶液染色5 min后，用蒸馏水冲去多余染液，放到显微镜下观察。并根据大鼠阴道涂片细胞变化明确大鼠所处性周期阶段。见表1。

表1 大鼠发情各期阴道细胞涂片表现

3．2 子宫指数和卵巢指数

脏器指数=器官湿重/体重，卵巢指数和子宫指数计算公式如下［2］:

再次，山东省虽然不是资源集中地，却是当之无愧的中国复合肥发展的前沿阵地和市场先行者。山东临沂临沭县作为“中国复合肥之乡”，大批复合肥企业齐聚于此，形成了完备的市场体系，相关附加产业的发展也十分完善，原料、人才、运输、销售各方面优势均十分明显，倍丰盐湖农业科技坐落于此，占据了地理优势。

3．3 卵巢黄体出现率

3．3．1 组织固定及石蜡包埋［3］

把卵巢放入10%中性甲醛溶液固定。切取卵巢组织块约4mm，流水冲洗，然后常规脱水至透明，进而浸蜡、包埋、切片。

3．3．2 苏木精－伊红(HE)染色

蜡块切片后常规处理，行HE染色，具体操作步骤严格按照说明书进行。光镜下观察各组大鼠双侧卵巢黄体的出现情况，黄体出现率为每个卵巢出现的黄体个数［2］。

4 实验结果

4．1 阴道细胞涂片

图1 发情期(×100)

图2 发情后Ⅰ期(×100)

图3 发情后Ⅱ期(×100)

图4 发情间期(×100)

图5 发情前期(×100)

4．2 子宫指数和卵巢指数 见表2。

表2 各组大鼠的子宫指数和卵巢指数比较(±s)

表2 各组大鼠的子宫指数和卵巢指数比较(±s)

注:与模型组比较，#P ＞0．05，★P ＜0．05。

空白组 10 1．15 ±0．15★ 0．44 ±0．10★模型组 10 2．55 ±0．94 0．70 ±0．62西药组 10 1．41 ±0．49★ 0．46 ±0．10★中低组 10 2．48 ±0．83# 0．72 ±0．13#中中组 10 1．31 ±0．27★ 0．53 ±0．49★中高组 10 1．45 ±0．55★ 0．49 ±0．65★

结果显示，中低组与模型组子宫指数、卵巢指数比较无显著性差异(P＞0．05);空白组、西药组、中高组、中中组与模型组大鼠子宫指数、卵巢指数比较有统计学意义(P＜0．05);空白组、西药组、中高组、中中组之间比较子宫指数、卵巢指数无显著性差异(P＞0．05)。

4．3 卵巢黄体出现率 见表3。

表3 各组大鼠的卵巢黄体出现率比较(±s)

表3 各组大鼠的卵巢黄体出现率比较(±s)

注:与模型组比较，#P ＞0．05，★P ＜0．01。

空白组 10 0．75 ±0．96★模型组 10 4．00 ±0．82西药组 10 1．25 ±0．96★中低组 10 3．75 ±0．50#中中组 10 2．00 ±0．82★中高组 10 1．00 ±0．82★

结果显示，中低组与模型组卵巢黄体出现率比较无显著性差异(P＞0．05);空白组、西药组、中高组、中中组与模型组大鼠卵巢黄体出现率比较有统计学意义(P＜0．01);空白组、西药组、中高组、中中组之间比较卵巢黄体出现率无显著性差异(P＞0．05)。

5 讨论

大鼠处于发情周期的不同阶段，阴道粘膜也会随之发生不同的变化。阴道粘膜上皮直接受卵巢内分泌功能的影响，故对雌激素的反应较为敏感，所以通过观察阴道细胞涂片可准确地了解卵巢的功能，判定其性周期的变化和第一个发情间期。由于阴道涂片法判定大鼠性周期具有简便、准确、实用等优点，故此法是目前常用的判定大鼠性周期的方法。

大鼠涂阴道涂片，进一步验证NMA诱导的雌性大鼠性早熟模型是真性性早熟模型。

实验结果显示，中药高剂量组、中药中剂量组的子宫指数、卵巢指数均小于模型组，且有统计学意义(P＜0．01);同时与空白组比较无显著性差异(P＞0.05)，表明龟贞地黄饮能够在一定程度上减少子宫指数、卵巢指数，抑制卵巢黄体的出现，从而也提示龟贞地黄饮能使大鼠的性腺发育和功能状态维持在正常青春前期水平。

［1］ 孙丽英，高微，胡晓阳，等．中医学对儿童性早熟病因病机的认识［J］．中医药学报，2012，40(4):10－11．

［2］ 孙丽英，于秋爽，胡晓阳，等．龟贞地黄饮对性早熟模型大鼠LH、E2含量的影响［J］．中医药学报，2012，40(6):18－19．

［3］ 孙青．滋阴泻火方干预真性性早熟模型大鼠的实验研究［D］．南京:东南大学，2006．