中西医结合对急性脑出血大鼠脑组织NSE、S100 表达的研究

梁群，赵慧芳，朱永志

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

脑出血，属于中医学中出血性中风，是一种常见病、多发病，已经证实其患病率、致残率及病死率均有所上升。目前，现代医学对脑出血主要是对症、支持治疗，如脱水降颅压，防治脑组织细胞水肿等，其预后效果并不理想。本研究主要是通过观察中风1号汤剂对急性脑出血大鼠的神经缺损功能以及改善脑水肿症状的作用，并测定在中药干预后，NSE及S100 mRNA浓度的变化，探讨中风1号治疗急性脑出血的疗效，为中西医结合治疗急性脑出血提供一定的参考。

1 材料与方法

1．1 实验动物

Wistar大鼠30只，体质量(200±15)g，均为雄性，黑龙江中医药大学实验动物中心提供，清洁级标准饲养。

1．2 主要仪器及试剂

50ul及100ul微量进样器、大鼠灌胃器(上海佳安仪器厂);大鼠脑立体定向仪(北京博大泰克公司);电子天平(上海精密科学仪器有限公司);手持式牙科钻(上海齿科医械厂);大鼠断头器、大鼠脑切片模具(湖北省黄石市医疗器械厂);Olympus DX40 光学显微镜(日本Olympus公司);光学显微照相系统(日本Olympus公司);电热恒温箱(WMK－02型);DY－1型水平电泳仪、ZF－1型紫外线透射反射分析仪(重庆四达实验仪器有限公司);GIS数码凝胶成像系统(北京联想有限公司);即用型SABC免疫组化染色试剂盒(上海惠普公司);NSE兔抗鼠单克隆抗体、S100 兔抗鼠单克隆抗体和POLY－L－LYSINE(多聚赖氨酸)(北京中杉公司);DAB显色试剂盒、PBS缓冲液和磷酸缓冲液和总RNA快速提取试剂盒(上海惠普公司)。

中风1号主要是由黄芪、川芎、当归等中药配伍而成(黑龙江中医药大学附属第一医院院内制剂);肝素钠注射液(12500U/2ml，2ml×10 支);20%甘露醇(250ml/瓶);注射用青霉素钠(160 万u/瓶);琼脂糖(上海生工生物工程技术有限公司)。

2 实验方法

2．1 动物分组

将30只雄性大鼠随机分为3组，每组10只，分别为模型组，对照组，实验组(即中风1号加用甘露醇组)。测定大鼠脑组织NSE及S100 mRNA的变化。

2．2 造模

大鼠急性脑出血模型:根据参考文献［1－7］制备大鼠脑出血模型，出血量经过计算，约等同于人脑出血量10ml，20ml，30ml，40ml。

2．3 给药

对照组:生理盐水，1．5ml/次，灌胃 1次/日，腹腔注射1次/日。模型组:生理盐水加甘露醇，1．5ml/次，灌胃1次/日，腹腔注射1次/日。实验组:中风1号汤剂加甘露醇，1．5ml/次，灌胃1次/日，腹腔注射1次/日。以上动物在造模术后，分别持续给药3天。HE染色观察大鼠脑组织出血后，血肿周围组织形态。

用免疫组化法，测定大鼠脑组织中NSE、S100的表达。

2．4 石蜡切片微波修复抗原染色程序 1)烤干切片;2)热修复抗原;3)自然冷却后PBS(pH=7．0)洗涤3次，每次5min;4)在25℃ ～27℃下灭活内源性酶;5)灭菌蒸馏水洗涤，PBS水洗，3次，每次5min;6)加5%BSA的封闭液，室温下1h;7)5℃下，去掉余液体，加一抗;8)滴加生物素化鼠抗兔IgG;9)滴加试剂SABC;10)PBS重复洗3次;11)DAB显色;12)于镜下观察，复染，分化，返蓝;13)脱水并封片处理。

TA克隆后通过PCR鉴定阳性克隆送测序，测序结果结果经过BLAST比对除去载体序列及与原MLAA-22重叠的部分后，在5'端延伸了424 bp。

2．5 图像的分析及处理 光镜下可见，阳性着色为神经细胞的胞浆被染成黄色、棕黄色或棕褐色。显微镜采集视野图片，用图像分析仪观察每张切片，同时测定脑组织中NSE和S100的值，每张切片均取5～6个视野，取其平均值。

2．6 大鼠脑组织中 NSE及 S100 mRNA的水平的测定

2．6．1 提取脑组织中总RNA1)取大鼠的脑组织(约250mg)，将脑组织研磨成粉状(要在液氮中进行)，将粉末快速转移到 5．0ml的离心管内，再加2.0ml Trizol，剧烈摇动离心管。2)加200ml的氯仿/异戊醇(20∶1)，摇晃约 1 min使其混合均匀。3)15000rpm离心3min。4)将大约500ul的上清液转移到2．0ml离心管中，加入100ul无水乙醇，混匀。5)将溶液全部转移到2ml收集管内(在GenClean柱中)，5min后离心。6)取出柱子后扔掉废液，再将柱子放回管中，400ul RPE－Solution 13000rpm离心30s;于术后第3天，采集血清，测脑组织NSE及S100的浓度，称重后戊巴比妥钠麻醉，大鼠脑组织以针道为中心，前后各取脑片3mm，一片置于福尔马林中固定，另一片置于液氮中冷冻。7)步骤6 重复1次。8)先将柱子取出来，收集管放回后离心，再次把柱子放进离心管中。9)给内膜中间加进去 40ul的 DEPC－H2O，90℃，15000rpm下离心3min，可得到RNA样品，即管内的溶液。10)测OD值 (取260/280)，比值大于2．0的(包括2．0)，算出得到的RNA总的含量，取其中的10μg做逆转录。11)调节RNA浓度至10μg/μl。

RNA总的浓度=A260×50/2000×稀释的倍数

2．6．2 RT(逆转录)反应

逆转录总的反应体积约20μl，每组均设有3个复管。在Eppendorf管中加3μl OligdT和2ul RNA，变性(75℃)，在置入冰中后，依次加入:dNTP 2μl，DEPC 水10ul，5 × Buffer 5μl、Rnasin 2．0μl、AMV 0．5ul。50℃反应1．5h，将产物保存于零下20℃冰箱内。

2．6．3 PCR(聚合酶链反应)

1)合成引物:据国际cDNA文库检索的原始序列，参照文献设计受体引物序列。2)聚合酶链的反应:总的反应体积为30μl，每组有3个复管。在PCR管中依次加:Buffer 5μl、dNTP 5μl、上游引物 1．5μl、下游引物1．5μl、cDNA 1．5μl、Taq 酶 2．0μl、无菌蒸馏水 20μl，加完后，把各个复管内的液体混匀。放入PCR仪，80℃下变性，10min。3)凝胶电泳琼脂糖:琼脂糖2.0g，加到50ml的TAE中，加热后摇匀，冷却至60℃，灌胶。泳道的上样量约为10μl的PCR产物，给其加5μl缓冲液，再电泳2．0h。观察电泳结果，运用凝胶成像系统，算出NSE和S100 及GAPDH的比值(产物条带面积×强度)。

2．7 统计学处理

运用SPSS 17．0 医学统计软件分析，实验数据采用均数±标准差(±s)表示，以P＜0．05 为有差异具有统计学意义，组间数据的比较用方差分析。

3 实验结果

3．1 各组大鼠脑组织形态的观察结果

正常NSE分布于神经元细胞的胞浆和突起中［6］，神经细胞结构整齐，形态正常，NSE阳性细胞呈棕黄色。造模成功后可观察到:细胞核呈深染的蓝色，神经元细胞的胞浆内广泛分布着深染的棕黄色，呈颗粒样的物质，尤其在出血区周围的细胞内，颜色深，而且着色面积也较大。模型组与对照组比较，均存在显著性差异(P＜0．05)，即在脑出血后，大鼠神经元细胞胞浆和突起中的NSE就会从细胞内释出;实验组与模型组相比，有显著性差异(P＜0.05)，即用中风1号汤剂可以有效地减少NSE的释出。

正常S100 蛋白阳性的细胞为神经胶质细胞，细胞膜完整，阳性物质均匀分布于胞核、胞浆和突起中，呈棕黄色［7］。实验观测到，造模成功的大鼠脑组织血肿周围的免疫反应增强，阳性细胞的数量也有一定的增加，同时在细胞间质中，也可见到阳性物质，颜色不均匀，说明存在脑细胞的破坏，尤其是出血量为51ul、65ul水平的则更为明显。模型组与对照组比较，有显著性差异(P＜0．05);实验组与模型组相比，具有显著性差异(P＜0．05)，即药物治疗对于脑出血有明显的改善作用。

3．2 各实验组大鼠脑组织中NSE和S100 mRNA的含量测定

凝胶电泳大鼠脑组织S100 和GAPDH的扩增产物，条带分别为272bp和490bp，扫描后半定量分析S100/GAPDH的吸光比值，研究得出:在急性脑出血后，造模大鼠的各个出血量水平S100 mRNA的表达和对照组相比，均具有统计学意义(P＜0．05)，即脑出血后S100 mRNA的表达增高，尤其是51ul、65ul水平S100 mRNA的表达升高最显著，说明S100 mRNA也是监测脑组织损伤特异、灵敏的指标;实验组与模型组比较，有显著性差异(P＜0．05)，即使用中西医药物联合对于治疗脑出血有明显的改善作用。见表1～3。

表1 各组大鼠脑组织出血灶周围NSE的表达(±s，n=10)

表1 各组大鼠脑组织出血灶周围NSE的表达(±s，n=10)

注:与对照组比较，*P ＜0．05，＊＊P＜0．05;与模型组比较，△P ＜0.05。

对照组0．09 ±0．02 0．08 ±0．03 0．11 ±0．05 0．07 ±0．04模型组 151．15 ±7．53* 155．58 ±8．88* 160．24 ±6．92* 167．31 ±7．61*实验组 139．12 ±8．53＊＊△ 146．45±7．05＊＊△ 151．09±8．97＊＊△ 155．15 ±6．93＊＊△

表2 各组大鼠脑组织出血灶周围S100 表达(±s，n=10)

表2 各组大鼠脑组织出血灶周围S100 表达(±s，n=10)

注:与对照组比较，*P ＜0．05，＊＊P＜0．05;与模型组比较，△P ＜0．05。

对照组0．08 ±0．03 0．06 ±0．02 0．13 ±0．10 0．07 ±0．03模型组 149．77 ±15．86* 155．22 ±16．53* 162．36 ±12．57* 170．76 ±14．81*实验组 129．94 ±13．97＊＊△ 136．53 ±14．81＊＊△ 149．32 ±13．897 152．18 ±15．23＊＊△

表3 各组大鼠脑组织S100 表达(±s，n=10)

表3 各组大鼠脑组织S100 表达(±s，n=10)

注:与对照组相比，*P ＜0．05，＊＊P＜0．05;与模型组比较，△P ＜0．05。

对照组0．03 ±0．01 0．04 ±0．02 0．07 ±0．03 0．05 ±0．02模型组 24．17 ±2．53* 25．08 ±3．27* 30．65 ±2．31* 32．22 ±3．27*实验组 18．53 ±4．38＊＊△ 20．69±3．51＊＊△ 23．57±5．07＊＊△ 27．09 ±3．73＊＊△

本实验退火温度从50℃ ～60℃，多次重复PCR循环过程，在各组的38ul、51ul水平上出现了相对清楚的目的基因条带，25ul和38ul也出现了目的基因条带，相对较弥散，初步考虑可能是因为S100 mRNA在脑组织中表达相对弱。

4 讨论

中风1号是由黄芪，川芎和当归等中药配伍而成，从中医理论立法处方，具有祛瘀通络，益气活血，扶正固本的功效，可缓解急性期脑出血和改善神经功能缺损的症状，有效改善患者预后，提高患者的生存质量，是治疗急性脑出血临床验方。

实验中使用中风1号干预后，明显调节了NSE和S100 mRNA在脑组织中的表达，随着出血量的增加其表达也逐渐增加，且NSE的变化比S100 更能直接的反映脑组织的损伤程度，同时从实验中也证明了中风1号可明显调控 NSE、S100的水平，保护损伤的脑组织。

从本实验研究的结果可以看出，实验大鼠的脑出血性损伤引起的神经功能缺损及脑水肿，实验组可有效的改善愈后，在降低NSE和S100 mRNA的方面，明显优于模型组。其作用机制还有待进一步的研究。目前我们推测其可能是因为中风1号有效的改善了脑部的血流动力学，使神经元细胞的细胞膜相对稳定，维持BBB正常的通透性，同时也减少组织液的渗出，减轻脑水肿，从而降低了NSE和S100 mRNA的释放，具有保护脑神经组织，改善患者预后的作用。本实验中的中西药物联合治疗急性脑出血，吸取了中西药各自的优点，证实了临床使用中风1号治疗急性脑出血是安全有效，为临床开展中西医结合治疗急性脑出血提供了一定的参考。

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