高效液相色谱法测定枸橼酸他莫昔芬凝胶剂在大鼠组织内的分布

朱 玲，邵彦江，李 敏，崔文琪，阿有梅，高珊珊，张振中

郑州大学药学院郑州450001

#通讯作者，男，1964年11月生，博士，教授，研究方向:肿瘤纳米给药系统研究，E－mail:zhangzhenzhong@zzu.edu.cn

他莫昔芬属于三苯乙烯非甾体抗雌激素类抗肿瘤药物，用于治疗乳癌［1－2］。他莫昔芬脂溶性强，口服后易在体内蓄积，不良反应较多，特别是对子宫和卵巢影响最大［3－4］。作者旨在研究枸橼酸他莫昔芬凝胶剂经大鼠乳腺周围组织皮肤局部给药后在大鼠体内组织分布的特征，为枸橼酸他莫昔芬凝胶剂的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料及仪器 雌性SD 大鼠50 只，体质量(250±30)g，购自河南省实验动物中心，动物合格证编号SCXK(豫)2005－0001。枸橼酸他莫昔芬对照品(阿利斯康中国公司，纯度99.8%);枸橼酸他莫昔芬凝胶剂(自制，质量分数1%);1100型高效液相色谱系统(Agilent 公司，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent ODS C18(5 μm，4.6 mm× 250 mm);柱温:25℃;流动相:甲醇和体积分数为1%三乙胺水溶液(体积比89 ︰11)，冰乙酸调节pH 至8.5;流速1.0 mL/min;检测波长280 nm，参比波长376 nm;进样量30 μL。

1.2.2 样品处理组织样品与Tris－HCl 溶液(Tris 6 g/L)混合匀浆，乳腺及卵巢组织每0.1 g 加入Tris－HCl溶液1 mL，子宫及肝脏组织每0.1 g 加入Tris－HCl 溶液0.5 mL。取浆液0.5 mL，加入甲醇1.5 mL，涡旋振荡3 min，离心(6 000 g)15 min，弃上清，56℃下氮气流吹干。残渣用100 μL 甲醇溶解，涡旋振荡1 min，离心(8 000 g)15 min，取上清液进行分析。

1.2.3 方法学验证 精密称取枸橼酸他莫昔芬对照品12.81 mg(约相当于“他莫昔芬”8.43 mg)，配制对照品贮备液，精密量取贮备液，以适量甲醇进行稀释，得系列浓度的对照品溶液;参照1.2.2 样品处理方法，以对照品溶液和空白组织匀浆液制备标准曲线样品及质控样品，考察标准曲线、准确度、精密度及样品的稳定性。

1.3 实验分组与他莫昔芬大鼠体内分布考察 SD大鼠50 只，随机分成实验组和对照组各25 只。给药前3 d 备皮，给药前禁食12 h，自由饮水。对照组灌胃给予浓度为0.8 g/L 枸橼酸他莫昔芬丙二醇溶液，给药剂量为10 mg/kg。实验组按50 mg/kg 的剂量给药(该剂量与口服10 mg/kg 枸橼酸他莫昔芬丙二醇溶液后血浆的达峰浓度水平接近［5］)，将枸橼酸他莫昔芬凝胶剂均匀涂布于大鼠乳腺组织周围(药物涂布总面积为12～16 cm2)。2组均每24 h给药1 次，连续给药3 d，并于末次给药后0、4、8、12、24 h 腹腔注射浓度为0.05 g/mL 的水合氯醛溶液处死大鼠，每个时间点处死5 只，剖取乳腺、肝脏、子宫及卵巢等组织。生理盐水冲洗组织表面浮血，用滤纸吸干水分后精密称取质量并记录，置于－70℃冰箱避光保存。按1.2.3 处理样品，进行分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 15.0 处理数据，对2组各时间点药物浓度的比较采用两独立样本的t 检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 方法专属性 色谱图见图1。他莫昔芬的保留时间为11.8 min 左右，峰形良好，基线平稳，与内源性物质分离良好(R≥2)。

2.1.2 标准曲线 各组织标准曲线在考察范围内线性关系良好，系数r 均＞0.999。各组织定量限的RSD 均＜15%(n=3)。

2.1.3 精密度及准确度 各组织匀浆液中他莫西芬的回收率82%～113%，批内差2.3%～13.4%(n=3)，批间差4.4%～10.4%(n=9)。

2.1.4 稳定性 各组织模拟生物样品高、中、低浓度样品回收率的RSD 均小于15%(n =3);回收率92%～113%，与新配制模拟生物样品的测定结果相比回收率没有显著变化(n=3)。

2.2 2组大鼠不同组织他莫昔芬浓度比较 各时间点实验组大鼠乳腺组织中他莫昔芬的浓度均高于对照组，2组达峰时间均为4 h。2组其他组织中他莫昔芬浓度差异无统计学意义。见表1～4。

图1 各组织样品色谱图

表1 各组织中他莫昔芬的回归方程

表1 2组大鼠不同时间点乳腺组织中他莫昔芬浓度比较 μg/g

表2 2组大鼠不同时间点子宫组织中他莫昔芬浓度比较 μg/g

表3 2组大鼠不同时间点卵巢组织中他莫昔芬浓度比较 μg/g

表4 2组大鼠不同时间点肝脏组织中他莫昔芬浓度比较 μg/g

3 讨论

他莫昔芬口服给药后体内组织分布较广，口服后非靶组织中的药物浓度相对较高，肝脏中的峰浓度甚至达到了乳腺组织的2 倍以上。

枸橼酸他莫昔芬凝胶剂经皮给药后，血浆中的达峰时间晚于口服给药(经皮约7.3 h，口服约2.5 h)［5］，而乳腺组织中药物的达峰浓度相同，且实验组各时间点大鼠乳腺组织中的浓度显著高于对照组，表明经皮给药后他莫昔芬可被迅速吸收进入乳腺组织，而进入全身循环的速度相对缓慢，表现出显著的趋向乳腺组织的分布特征。

该研究结果显示，与口服给药相比，枸橼酸他莫昔芬凝胶剂经乳腺周围皮肤组织给药，乳腺组织中的他莫昔芬浓度显著提高，而其他组织如子宫、卵巢、肝脏中药物浓度水平则相当，这可能是由于他莫昔芬凝胶剂在给药部位的皮肤及组织蓄积，形成暂时的药物储库，使乳腺组织内的药物浓度显著高于其他组织。这对于降低他莫昔芬对非靶组织的毒副作用、提高治疗效果十分有利。

总之，与口服给药途径相比，枸橼酸他莫昔芬凝胶剂经皮局部给药可增加乳腺组织对药物的吸收。

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［3］张丽萍，丁红，谢茵，等.高效液相色谱法测定枸橼酸他莫昔芬凝胶剂的含量［J］.中国药物与临床，2009，9(8):716

［4］李宏，姜继勇.他莫昔芬与子宫内膜癌［J］.国外医学:妇产科学分册，2005，32(3):189

［5］朱玲，王彩芳，阿有梅，等.枸橼酸他莫昔芬凝胶剂在大鼠体内的药动学研究［J］.中国医药工业杂志，2009，40(7):510