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黛力新及其组分对大鼠体内他莫昔芬及其代谢物的药动学影响

2022-07-18陈舒王鹏

浙江临床医学 2022年6期
关键词:黛力新美利甲基

陈舒 王鹏

他莫昔芬是非甾体类抗雌激素药,主要用于乳腺癌的辅助治疗[1]。他莫昔芬为前体药物,主要通过细胞色素P450 2D6酶(CYP 2D6)代谢成为具有生物活性的4-羟基-N-去甲基他莫昔芬(Endoxifen)。研究显示,抗抑郁药可不同程度地抑制CYP 2D6酶活性[2],影响他莫昔芬的体内代谢并增加乳腺癌的复发风险[3]。目前,他莫昔芬与抗抑郁药相互作用已得到国内外广泛关注。氟哌噻吨美利曲辛片(商品名:黛力新)为抗抑郁复方制剂,治疗乳腺癌伴焦虑抑郁具有较好效果[4-5],长期服用他莫昔芬的乳腺癌患者联合使用黛力新进行抗抑郁治疗是临床普遍采用的治疗策略。该研究旨在探讨黛力新、氟哌噻吨和美利曲辛对他莫昔芬在大鼠体内代谢的影响,以明确黛力新及其组分对他莫昔芬体内代谢的影响是否一致,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色谱、Xevo TQD型质谱仪(美国Waters公司),WA10005型十万分之一电子分析天平(上海方瑞仪器有限公司),XW-80A型涡旋混合器(海门其林贝尔仪器制造有限公司),TGL-16G型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),Mill-Q A10型超纯水系统(默克密理博有限公司)。

1.2 主要药品与试剂 盐酸氟哌噻吨标准品(上海创赛科技有限公司,批号J0612A,纯度99.0%),盐酸美利曲辛标准品(上海创赛科技有限公司,批号RQC226,纯度98.40%),他莫昔芬标准品(上海创赛科技有限公司,批号C10388213,纯度99%),N-去甲基他莫昔芬标准品(加拿大多伦多研究化学品公司,批号6-SKS-119-2,纯度98%),地西泮标准品(内标,西格玛奥德里奇上海贸易有限公司,纯度95%~105%),磷酸盐缓

冲液(PBS,北京索莱宝科技有限公司),甲醇、乙腈(色谱级,德国默克公司),甲酸(色谱级,德国默克公司),盐酸(分析级,北京化工厂公司)。

1.3 实验动物 健康清洁级雌性SD大鼠,体质量为(280±40)g,由温州医科大学实验动物中心提供,动物生产许可证号为SCXK(浙)2020-0001。该研究所有动物实验均通过温州医科大学实验动物伦理委员会和温州医科大学实验动物中心审查。

1.4 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm),柱温为40 ℃,流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液(梯度洗脱,见表1),流速为0.4 mL/min,进样量为2 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.5 质谱条件 离子源为ESI源,采用正离子检测方式;毛细管电压为2 kv,离子源温度为150 ℃,脱溶剂气温度为500 ℃,锥孔气流量为50 L/Hr,脱溶剂气流量为1,000 L/Hr;采用多离子监测模式,他莫昔芬、N-去甲他莫昔芬和内标地西泮的MS参数见表2。

表2 他莫昔芬、N-去甲他莫昔芬和地西泮的质谱参数

1.6 溶液的制备 (1)他莫昔芬标准溶液的配制:精密称取他莫昔芬标准品粉末10 mg,甲醇溶解后转至10 mL量瓶中定容并混匀,即得到质量浓度为1 mg/mL的标准溶液,于4 ℃保存备用。精密称取适量标准溶液用甲醇稀释成1、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1,000 ng/mL系列溶液。(2)N-去甲基他莫昔芬标准溶液的配制:精密称取N-去甲基他莫昔芬标准品粉末1 mg,甲醇溶解后转至10 mL量瓶中定容并混匀,即得到质量浓度为100 μg/mL的标准溶液,于4 ℃储存备用。精密称取适量标准溶液用甲醇稀释成1、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1,000 ng/mL系列溶液。(3)内标标准溶液的配制:精密量取1 mg 地西泮标准品至100 mL量瓶中,甲醇定容并混匀,即得质量浓度为10 μg/mL地西泮母液。再精密量取5 mL上述母液至另一100 mL量瓶中,加入甲醇稀释并定容,即得质量浓度为500 ng/mL的内标标准溶液,于4 ℃存备用。

1.7 实验方案和样本采集处理 将20只雌性SD大鼠实验前适应性饲养1周,随机分为空白对照组(0.3% CMCNa+0.24% DMSO)、氟哌噻吨组(0.21 mg/kg)、美利曲辛组(4.21 mg/kg)和黛力新组(氟哌噻吨0.21 mg/kg+美利曲辛4.21 mg/kg),每组各5只。各组给药剂量依据黛力新说明书临床等效最大给药剂量折算,药物配制时先使用0.5 mL DMSO溶解,再使用0.3% CMC-Na溶液溶解稀释。各组大鼠在给药前禁食12 h,但提供自由饮水,相应药物灌胃30 min后,各组均再灌胃他莫昔芬10 mg/kg(0.3% CMCNa溶解)。在给药结束后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h,大鼠尾静脉采集血样0.3 mL至含肝素的离心管中,以13,000 r/min离心10 min,获取血浆样品。取样品50 μL至1.5 mL离心管中,加入150 μL乙腈沉淀蛋白,加入30 μL的内标溶液,充分涡旋2 min后,以13,000 r/min离心5 min,取上清2 μL进样分析。

1.8 方法学验证 (1)专属性:分别取大鼠空白血浆、他莫昔芬组血浆样品和黛力新处理组大鼠2 h后血浆样品适量,按照上述样本方法处理,依据色谱条件和质谱条件分析样本,得到色谱图,见图1。他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬以及内标的保留时间分别为1.31、1.30、1.31 min。与对照色谱图比较,峰型良好,无干扰物,有良好的专属性。(2)线性范围及定量下限考察:取空白血浆180 μL,分别加入相应质量浓度的他莫昔芬(或N-去甲基他莫昔芬)标准系列溶液20 μL,涡旋混匀,配制成质量浓度为0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 ng/mL的他莫昔芬(或N-去甲基他莫昔芬)系列标准品的血浆样品溶液,样品处理后进样检测记录色谱图。以系列他莫昔芬(或N-去甲基他莫昔芬)标准血浆样品浓度为横坐标(x),待测物和内标的峰面积比为纵坐标(y)进行线性回归,得他莫昔芬的标准曲线方程为y=0.0310x+0.0097(R2=0.9961),N-去甲基他莫昔芬的标准曲线方程为y=0.0293x+0.0015(R2=0.9994)。两种药物浓度在0.1~100 ng/mL范围内线性关系良好,定量下限0.1 ng/mL(信噪比为10∶1)。(3)精密度与准确度:分别配制低(0.1 ng/mL)、中(2.5 ng/mL)、高(100 ng/mL)标准血浆浓度的他莫昔芬(或N-去甲基他莫昔芬),每个浓度平行制备6份。按照上述色谱质谱条件进样分析,同日内不同时间点连续测量6次考察日内精密度,连续3 d进样考察日间精密度。通过实测浓度和标示浓度的比较来考察准确度。结果显示,他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的日内日间精密度均<15%,准确度RE分别为-6.67%~1.43%和-4.18%~4.03%,结果均符合生物样本定量分析标准,见表3。(4)基质效应:取适量空白血浆进行样本处理,处理得到的上清液配制成低(0.1 ng/mL)、中(2.5 ng/mL)、高(100 ng/mL)浓度样品,各浓度平行6份,取2 μL按照色谱质谱条件进样检测,记录峰面积为A1(或B1)。用甲醇分别配制低、中、高浓度的他莫昔芬(或N-去甲基他莫昔芬)纯标准溶液,直接进样检测,记峰面积为A2(或B2)。以A1/A2(或B1/B2)分别计算基质效应,结果显示他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的基质效应均符合要求,见表4。(5)稳定性试验:按照“1.8.2”配制低(0.1 ng/mL)、中(2.5 ng/mL)、高(100 ng/mL)三种浓度的他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬空白血浆溶液,分别考察样品在室温、4 ℃、-80 ℃冻融3次和-80 ℃放置30 d后的稳定性。结果显示,各浓度样品在上述四种条件下RSD值均<15%,他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬血浆样品存贮在上述条件下稳定性良好,见表5。

表3 血浆样品中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的精密度与准确度(n=6)

图1 他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬以及内标色谱图

表4 血浆样品中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的基质效应(n=6)

表5 各贮备条件下血浆样品中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的稳定性(n=6)

1.9 数据处理方法 应用Origin 8软件分析各采血点的血药浓度并绘制药时曲线。采用DAS 2.0软件,选择非房室模型进行拟合分析,得到大鼠血浆他莫昔芬及其代谢物的药动学参数。使用SPSS 24.0软件对主要药代动力学参数进行统计学分析,计量资料符合正态分布以(±s)表示,组间比较采用t检验,以P<0.05表示有统计学差异。

2 结果

UPLC-MS/MS法测定各组大鼠血液中不同时间点他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的浓度,绘制平均药时曲线,见图2和图3。依据血药浓度求算的药动学参数,见表6和表7。结果显示,与对照组比较,氟哌噻吨能显著降低他莫昔芬的AUC(0-∞)(P<0.05)和Cmax(P<0.05),增加他莫昔芬CLz/F(P<0.05)。美利曲辛对他莫昔芬在大鼠体内过程无明显影响。黛力新显著降低他莫昔芬的Cmax(P<0.05),明显降低他莫昔芬的AUC和CLz/F,但差异无统计学意义(P>0.05),提示氟哌噻吨和黛力新对他莫昔芬体内代谢有不同程度的诱导作用。由图3、表7可知,与对照组比较,联用氟哌噻吨能显著降低N-去甲基他莫昔芬的AUC(0-t)(P<0.05)和Cmax(P<0.05),增加N-去甲基他莫昔芬CLz/F(P<0.05)。美利曲辛能显著增加N去甲基他莫昔芬在大鼠体内的清除率CLz/F(P<0.05),增加表观分布容积Vz/F(P<0.05)。黛力新降低N-去甲基他莫昔芬的AUC(0-t)(P<0.05),增加N-去甲基他莫昔芬的CLz/F,但差异无统计学意义(P>0.05),提示氟哌噻吨、美利曲辛和黛力新对N-去甲基他莫昔芬体内代谢均有不同程度的诱导作用。

图2 四组大鼠中他莫昔芬的药时曲线(n=5)

图3 四组大鼠中N-去甲基他莫昔芬的药时曲线(n=5)

表6 4组大鼠血浆中他莫昔芬的主要药动学参数[(±s),n=5]

表6 4组大鼠血浆中他莫昔芬的主要药动学参数[(±s),n=5]

注:与他莫昔芬组比较,*P<0.05

参. 他莫昔芬. 他莫昔芬+氟哌噻吨组他莫昔芬+美利曲辛组他莫昔芬+黛力新组AUC(0-t)(ug·h/L)1,169.64±256.92 755.36±144.55 1,034.03±266.26 890.24±114.50 AUC(0-∞)(ug·h/L)1,193.00±268.39 779.86±137.79*. 1,073.81±264.15 923.92±143.52 MRT(0-t)(h. 8.18±1.18 7.16±1.03 7.64±0.74 7.78±1.05 MRT(0-∞)(h. 8.55±1.27 7.69±0.94 8.40±1.25 8.56±1.45 t1/2z(h. 3.54±0.43 3.46±0.84 4.48±0.99 4.13±1.43 Tmax(h. 5.20±2.28 6.40±0.89 6.00±1.41 5.20±1.79 CLz/F(L/kg. 0.009±0.002 0.013±0.003*. 0.010±0.002 0.011±0.001 Vz/F[L/(h·kg)] 0.045±0.013 0.064±0.007 0.065±0.030 0.064±0.017 Cmax(ug/L. 137.74±37.28 93.71±21.24*. 123.02±16.62 92.74±12.63*

表7 大鼠血浆中N-去甲基他莫昔芬的药动学参数(n=5)

3 讨论

他莫昔芬在体内第一步代谢主要经过CYP2D6和细胞色素P450 3A酶(CYP3A)代谢成中间体N-去甲基他莫昔芬,进而再由CYP2D6第二步代谢为主要活性代谢产物Endoxifen来发挥抗肿瘤作用[6-7]。研究显示,他莫昔芬活性代谢产物血药浓度低,临床长期服用4个月才能达到较高的稳态血药浓度[8-9],所以本实验方法未能检测到Endoxifen血药浓度与单剂量他莫昔芬给药后大鼠体内Endoxifen血药浓度偏低有关,但其中间代谢产物N-去甲基他莫昔芬在某种程度会直接影响Endoxifen的血药浓度[10],并与他莫昔芬表现的不良反应有关[11]。因此,该实验通过测定他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的药物浓度变化来阐明药物代谢变化情况,还建立了同时测定大鼠血浆中他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的UPLC-MS/MS定量分析方法,相较于胡东莉等[12]的测量方法,该方法采用分离度更好的1.7 μm色谱柱,样品处理采用更为简便的蛋白沉淀法,具有更好的分离度与峰形,其灵敏度满足血浆检测要求,且已成功用于药动学实验研究。

他莫昔芬第二步代谢实验结果显示,氟哌噻吨、美利曲辛和黛力新均能不同程度地诱导N-去甲基他莫昔芬转化成Endoxifen,说明黛力新的诱导作用是氟哌噻吨和美利曲辛共同作用的结果。N-去甲基他莫昔芬主要通过CYP2D6酶转化为活性成分Endoxifen,且研究显示抗抑郁药会通过影响CYP2D6酶活性来影响他莫昔芬的体内代谢过程[13],因此笔者猜测氟哌噻吨和美利曲辛可能通过诱导CYP2D6酶活性来促进N-去甲基他莫昔芬的代谢过程,而该诱导作用理论上能减少N-去甲基他莫昔芬的血药浓度,增加活性代谢产物Endoxifen,前者与药物的不良反应相关,后者与药物的疗效相关,可见黛力新对他莫昔芬具有减毒增效的作用。

他莫昔芬第一步代谢实验结果显示,氟哌噻吨和黛力新对他莫昔芬的第一步代谢过程有不同程度的诱导作用,但黛力新的诱导作用较氟哌噻吨弱,说明黛力新对他莫昔芬代谢的诱导作用与其中的氟哌噻吨有关,且在联用美利曲辛后氟哌噻吨的诱导作用有所减弱。初步代谢过程涉及的代谢酶,除CYP2D6外还有CYP3A等其他肝药酶代谢通道。由此推测,美利曲辛对其他肝药酶通道的抑制作用使得黛力新对他莫昔芬初步代谢过程的诱导作用弱化。

综上所述,黛力新对他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬的体内代谢过程不仅无抑制作用,还显示出一定的诱导作用,而且该诱导作用可能与药物对肝药酶的影响有关,理论上会提高他莫昔芬的疗效和降低不良反应,但该观点仍需进一步研究验证支持。

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