三个亨廷顿舞蹈病家系APEX基因氧化还原功能区变异检测

周 璐，姜 楠，魏志茹，陈文哲，申梦姣，崔健健，李晓文

1)郑州大学临床医学系 郑州450052 2)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州450001

#通讯作者，女，1955年8月生，本科，教授，研究方向:遗传病的分子机制与基因诊断，E-mail:Lixiaowen@zzu.edu.cn

亨廷顿舞蹈症(Huntington's disease，HD)是以神经系统退行性改变为主要特征的常染色体显性遗传病，主要由于IT15 基因CAG 重复序列异常扩增，导致其所编码的亨廷顿蛋白结构与功能异常［1］。临床上表现为慢性进行性加重舞蹈样动作、认知及精神障碍的“三联征”，多在30 至40 岁发病，患病后15～20 a 死亡。脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶(aprimidinic/apurinic endonuclease/redoxfactor-1，APEX)是碱基切除修复途径的关键酶之一，并作为一种多功能蛋白，在一些神经系统病变中发挥着重要的作用。该研究初步探讨APEX 基因氧化还原功能区变异与亨廷顿舞蹈症发生的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 3 个HD 家系均来自河南省，获知情同意后，共抽取26例正常个体和10例HD 患者外周静脉血各3 mL，所有受检者均经IT15 基因诊断。

1.2 APEX 基因变异的检测 采用单链构象多态性(SSCP)检测。采用酚-氯仿法提取基因组DNA。APEX 基因(ACCESSION:M92444)氧化还原功能区序列来源于GenBank，利用Primer 软件，设计第1～3 外显子的扩增引物(表1)。3 个外显子的多态性位点在Genewindow 查得:E1 有8 个多态性位点，E2 不含多态性位点，E3 有5 个多态性位点。引物合成由上海生工公司完成。

表1 PCR 扩增引物及扩增片段长度

反应体系共20 μL:Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模版2 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反应条件:95℃预变性5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30 个循环;然后在72℃条件下延伸7 min;4℃保存。制备8 g/L 非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联比为49:1)，0.5×TBE 预电泳30 min。将PCR 产物加样电泳，130 V 电压12 h，银染显色。数码相机拍照并制成干胶保存。患者和家系正常个体扩增产物由北京金唯智生物公司测序。

2 结果

所有样本APEX 基因的3 个外显子扩增片段均未发现异常电泳条带。将3 个家系内的正常个体和HD 患者的扩增产物进行DNA 测序和比对，正常个体与HD 患者之间未发现差异，部分结果见图1、2。

3 讨论

HD 的病理改变表现为具有高度区域选择性的脑萎缩和神经元脱失。化学性质活泼的自由基是脑缺血再灌注、阿尔茨海默病和肌萎缩性侧索硬化症等神经退行性疾病、脑动脉粥样硬化等神经系统病变的重要原因之一［2-4］，APEX 可作为调节真核细胞基因表达的氧化还原信号传导蛋白［5］，影响着氧化应激下的细胞生存，在上述神经系统病变中发挥着重要的作用［6］。作者检测亨廷顿舞蹈病家系成员中APEX 基因氧化还原功能区，以探讨亨廷顿舞蹈病的发生中是否有该基因变异。

1989年日本Orita 等［7］最早使用SSCP 技术。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳［8］，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。结合PCR 技术，可灵敏地检测已知突变，筛选未知突变。该研究采用SSCP-DNA 测序的方法检测亨廷顿舞蹈病家系成员中APEX 基因氧化还原功能区的3 个外显子，可检测多个多态性位点的改变，避免了酶切技术造成的大工作量。

DNA 损伤存在多种修复机制，包括碱基切除修复、核苷酸切除修复、错配修复和重组修复等，其中碱基切除修复(base excision repair，BER)是纠正自发突变和外源性活性化合物引起DNA 损伤的最活跃途径，在维持遗传物质稳定性方面具有重要作用。Jakupciak 等［9］认为:DNA 合成中，DNA 复制叉遇到CTG 或CAG 重复序列时会在2 条链上形成断裂，并产生40～400 个重复单位的缺口，启动重组修复过程。APEX 是BER 修复途径的限速酶［10］，与DNA 聚合酶、连接酶等相互作用，促进DNA 的修复。APEX 可在AP 部位的5'端切断DNA 链，亦可在3'磷酸残基形成3'-羟基引物，参与长补丁修复。APEX 修复功能的缺失可导致基因突变和微卫星不稳定。该研究结果未见HD 患者APEX 基因变异，表明该基因氧化还原功能区变异不是导致HD 患者IT15 微卫星序列异常扩增的危险因素。

［1］高歌，陈晓蕾，付汪星，等.两个亨廷顿舞蹈病家系IT15基因(CAG)n 检测［J］.郑州大学学报:医学版，2010，45(6):936

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［3］Shaikh AY，Martin LJ.DNA base-excision repair enzyme apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor-1 is increased and competent in the brain and spinal cord of individuals with amyotrophic lateral sclerosis［J］.Neuromolecular Med，2002，2(1):47

［4］Hall JL，Wang X，Van Adamson，et al.Overexpression of Ref-1 inhibits hypoxia and tumor necrosis factor-induced endothelial cell apoptosis through nuclear factor-κB independent and dependent pathways［J］.Circ Res，2001，88(12):1247

［5］陈欣，刘艳霞.APE/Ref-1 在中枢神经系统氧化应激反应中的保护作用［J］.中国生物化学与分子生物学报，2006，22(5):355

［6］Prabhakar NR，Kumar GK，Nanduri J，et al.ROS signaling in systemic and cellular responses to chronic intermittent hypoxia［J］.Antioxid Redox Signal，2007，9(9):1397

［7］Orita M，Suzuki Y，Sekiya T，et al.Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction［J］.Genomics，1989，5:874

［8］乐晓萍，杜鹏，张钦宪，等.聚丙烯酰胺凝胶银染技术改良［J］，郑州大学学报:医学版，2001，36(4):395

［9］Jakupciak JP，Wells RD.Gene conversion (recombination)mediates expansions of CTG［middle dot］CAG repeats［J］.J Biol Chem，2000，275(51):40003

［10］Evns AR，Limp-Foster M，Kelley MR.Going APE over ref-1［J］.Mutat Res，2000，461(2):83