奶牛性控冻精生产工艺改进及效果分析

赵宪林，李耀坤，田万强，胡建宏，昝林森＊，王韦华

在给动物授精之前对精子进行有目的的选择，即将X和Y精子分离，是实现性别控制最理想的途径［1］。人们对性控精液在奶牛生产中的应用期盼已久，近年来荧光活性细胞的分类将该技术带到了商业应用的边缘。利用冷冻的性控精液和XY精子的分选技术将增强生产者获得廉价后备母牛的能力，加快牛群扩繁进度提高繁殖效益［2］，但该技术依然受到分选速度低、成本价格高及授精率低三种限制因素的制约［3，4］。研究提高性控精液品质、授精率及降低生产成本显得非常重要。

从20世纪50～90年代，有许多人用物理法和免疫法进行分离X精子与Y精子的试验研究，虽然都曾有成功的报道，但是通过荧光原位杂交技术（FISH）和流式细胞仪测定技术，对上述方法分离后的精子进行检测发现，无论是物理学方法还是免疫学方法都缺乏可靠性和可重复性。直到20世纪80～90年代，以X和Y精子DNA含量存在差异为原理，应用流式细胞仪分离X和Y精子技术才取得突破性进展，目前经分离的X和Y精子已经在畜牧生产上得到了应用。但是由于生产技术复杂及高成本因素及受胎率低的影响，使得性控精液推广难度很大，使得这一技术不能很好的服务于广大奶农。所以，研究提高性控精液品质、降低性控精液生产成本、加大精液分离速度成为当今研究热点。

本研究以西北农林科技大学和大庆田丰生物工程有限公司为试验基地，通过对其性控冻精稀释液配方、精子分离设备的改进，达到提高性控冻精品质、降低性控冻精生产成本的目的，为性控冻精的高受胎率低价格提供必要的理论依据。

1 试验仪器与试剂

主要仪器：流式细胞仪，电热恒温培养箱（HHB11·500型），电子分析天平（JA1003型），细管一体机（法国，DIGITCOOL－5300型），比色密度测定仪（法国，RS－232型），自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂，SZ－93型），无菌操作台显微镜。

2 试验地点与方法

2.1 试验地点

本研究在西北农林科技大学和大庆田丰生物工程有限公司开展。

2.2 精液采集

选择年龄2～5岁，体质健壮、繁殖性能良好的3头荷斯坦种公牛。利用假阴道法在每周二、五早上9点钟采精。鲜精经过常规检测分析，活力大于0.60，密度为1.5×109mL－1以上的正常精液用于本次试验。

2.3 精子处理

1）精子分离环境：十万级空气过滤，20℃室温。

2）分离前处理：根据原精浓度取4亿精子进行染色处理。取14uL H33342荧光染色液放入5mL专用试管，加入2mL TALP液与4亿精子混合。

3）试验中精子染色温度为34℃，避光孵育30min，然后加入2mL 4%卵黄TALP液。

4）分离机启动调试及处理并启动分离系统。

5）每管样品分离1～1.5h，分取精子1 500～2000万，然后换管。

6）分离精液的冷冻：①分离精液平衡；②分离后的精液在20℃条件下1 800转／min离心5min；③除上清液加冷冻精液保护液；④分离精液装管打印标记并冷冻上架。

2.4 精子质量检测

2.4.1 精子活率的检测 本次试验精子活率由肉眼观察进行测定［5］。

2.4.2 精子顶体完整率的检测［5］细管冻精解冻后，将细管中间的一滴精液滴于载玻片的左端，用另一张边缘光滑的载玻片呈35°角自右面接触液滴，拉向另一侧，制成抹片。自然风干5～10min后，用福尔马林磷酸盐固定液固定15min，水洗干燥后，用姬姆萨染色90min，自来水冲洗，干燥，显微镜下观察300个精子，统计顶体完整的精子数。

2.5 统计分析

所有数据均用平均数±标准差表示，采用SPSS13.0软件进行分析，用卡方检验进行检验。

3 生产工艺改进及效果分析

3.1 精子分离设备激光系统的改进及效果

经过数位专家的论证及课题组研究生多次实验探索，首先从仪器着手，对精子分离设备的激光系统进行改造，把原亚离子紫外激光换为固态锁模紫外激光。其次，为进一步提升设备的分离速度，实现增产降耗，在项目组专家的指导下，企业更换了原有的计算机系统，配备了经过升级的X、Y精子分离软件系统，使设备的分离速度得到了进一步提高。

3.1.1 精子分离速度提高情况 通过对比发现，更换后精子的分离速度从原来的3 400个／s提高到5 400个／s，分离速度提高58%以上。更换激光系统后，精子分离速度得到大幅提升。究其原因，数位专家一致认为可能是原亚离子紫外激光换为固态锁模紫外激光并升级X、Y精子分离软件系统后，提高了激光的稳定性，增强了设备对X、Y精子的分辨力，从而增加了精子分离速度。

3.1.2 每支细管有效精子数提高与生产成本降低情况 在本次试验中把原亚离子紫外激光换为固态锁模紫外激光后，分离速度达到5 400个／秒，比原来分离速度提高58%以上，大大提高了性控精液的生产效率。并大幅降低了生产成本。精子分离速度增加，一方面每支细管有效精子数达210万以上，比改进前的170万提高了近40万有效精子数；另一面，分离速度的提高造成生产效率提高，为此显著节约了生产成本。生产工艺改进之前，每支性控精液成本价为81元，工艺改进后，生产效率提高58%以上。可以看出精子活率提高6.17%，授精率提高7.25%，相当于提高了种公牛7.25%的利用率，则每支性控精液成本则降低至40元以下。

3.2 性控冻精保护液配方改进及效果

经多方调查研究认为原精子保护液在精子冷冻过程中不能起到积极的保护作用，导致冷冻解冻后精子品质较差。经过多位专家讨论、课题组老师及学生反复试验，最后对精子保护液配方进行了改进，改进后性控冻精解冻后精子品质得到了显著提高，同时对精液中抗氧化物酶的活性起到了积极的保护作用。原保护液配方及改进型保护液配方及效果如下：原精子保护液配方：2.9%柠檬酸钠、12%蔗糖液，卵黄20%，甘油6%。庆大霉素1.3mL，林肯霉素0.3mL。改进型保护液配方：海带多糖0.2%、葡萄糖2%、柠檬酸钠1.0%、蒸馏水70%、白蛋白15%、甘油8%、青霉素9万IU。

3.2.1 工艺改进前后精子活率和顶体完整率对比性控精液生产工艺改进前后对精子的常规品质见表1。由表1可以看出，工艺改进后，精子活率提高11.30%，差异达到显著水平（P＜0.05）；顶体完整率提高11.06%，差异达到显著水平（P＜0.05）。精液在冷冻过程中精子死亡率高，活率低［6－8］。造成性控精液精子活率低的原因可能是精子经过复杂的程序处理，在进入冷冻程序之前处理时间太长，精子能量消耗较大，活力减弱。分离后活力弱的精子可能会在冷冻解冻过程中大量死亡，有效精子数减少，活率降低。顶体完整率和精子的受精率相关，顶体受损，导致顶体酶流失，使精子失去受精能力。但是本试验表明，生产工艺改进后，精子活率顶体完整率和授精率得到较大提高。分析其原因，可能是保护液在精子处理过程中起到了较大的保护作用。

表1 工艺改进前后性控精液中精子活率和顶体完整率比较

3.2.2 工艺改进前后精液中抗氧化物酶活力对比性控精液生产工艺改进前后，精液抗氧化物酶水平变化见表2。由表2我们可以看出工艺改进后，过氧化氢酶活性显著提高，差异达到显著水平（P＜0.05）；谷胱甘肽过氧化物酶活性显著提高，差异达到显著水平（P＜0.05）；超氧化物歧化酶和谷胱甘肽还原酶活性有所提高但没有达到显著水平（P＞0.05）。

表2 工艺改进前后性控精液中抗氧化物酶活力比较

精液中的抗氧化物酶具有清除精液中活性氧促离子自由基，在精子存活及授精过程中有重要的保护作用［9，10］。在本次试验中，发现过氧化氢酶显著提高，谷胱甘肽过氧化物酶显著提高，差异都达到了显著水平（P＜0.05）；超氧化物歧化酶和谷胱甘肽还原酶虽然没有达到显著水平（P＞0.05），但是酶活力依然比工艺改进前略高。原因可能是过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性较强，并在精液处理过程中得到了精子保护液中某种物质的保护；超氧化物歧化酶和谷胱甘肽还原酶没有得到显著提高，可能是酶活力本身活性较差，并且在精液处理过程中没有得到有效保护。

3.2.3 工艺改进后体外授精率及犊牛性别控制准确率分析 性控精液生产工艺改进前后，体外授精率及犊牛性别控制准确率见表3。

表3 工艺改进后体外授精率及犊牛性别控制准确率比较

在性控冻精工艺改进前，由于每支细管中有效精子数较低且品质较差，故授精率较低。改进后性控冻精生产工艺不但加大了对精子的保护力度，并提高了犊牛性别控制准确率。在实际生产应用中受胎率达到82%，比工艺改进前提高7.9%；犊牛性别控制准确率达到了95.2%，比工艺改进前提高3.5%。

综上所述，性控精液生产工艺改进后，显著提高了精子活率、顶体完整率、母牛受胎率、犊牛性别控制准确率，并且提高了精液中抗氧化物酶活性，加快了分离速度，提高了每支细管有效精子含量，同时大幅降低了生产成本。使生产成本降至40元以下。

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