低温胁迫后抗寒茶树品种‘紫阳圆叶’的基因差异表达分析

程国山，游新才，武 艳，张今今，①

(1.陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710062;2.陕西省紫阳县茶叶研究所，陕西紫阳725300)

茶树〔Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.〕隶属于山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia Linn.)，为多年生喜温叶用经济植物，原产于中国云南，自然分布于中国西南和华南，在东南亚北部也有分布。随着人类的引种栽培活动范围扩大，茶树的种植区域也由南向北逐渐迁移。近年来由于全球气温变化不稳定，“倒春寒”和“霜冻”等低温寒害在中国茶区频繁发生，严重影响茶叶的产量和品质，低温已经成为制约茶叶产业发展的最主要的气象灾害［1］。因此，研究茶树的抗寒机制、筛选优良的茶树抗寒基因、提高茶树抵御低温灾害的能力，已经成为茶叶科学领域重要的研究课题之一。

陕西省秦巴山区种茶产茶历史悠久，茶树资源分布广泛，遗传多样性丰富［2］。陕南茶区作为中国茶树适宜生长区的最北缘，较南方茶区纬度高且年平均气温低。在经历漫长的繁衍和进化过程后，长期处于低温环境中的秦巴山区地方茶树种质有可能产生对低温胁迫耐受的形态和生理生化特征，具备一定的抗寒性。鉴于此，在前期对23个陕西地方茶树品种以及6个外地引进茶树品种的抗寒性进行综合评价的基础上，作者所在的研究小组筛选出了包括‘紫阳圆叶’(‘Ziyangyuanye’)在内的陕西省特有的优良抗寒茶树品种［3］。

早期茶树抗寒性研究多集中在茶树叶片解剖结构与抗寒性关系以及低温胁迫下叶片细胞原生质膜透性、水分含量、抗氧化酶类活性和光合作用或呼吸作用强度等生理生化指标的变化方面［4-6］。随着分子生物学理论和技术的不断发展，有关茶树低温胁迫和抗寒性分子机制的研究取得了显著进展。目前，通过对低温和常温下基因表达差异进行比较以分离茶树在低温胁迫下差异表达的基因是茶树抗寒性分子机制研究的主要方法［7-8］。在用于克隆差异表达基因的方法中，DDRT-PCR技术所需的RNA量少、重复性好，是分析植物基因差异表达的有利工具，已被广泛应用于植物抗逆性研究［9］。

近年来，以陕西地方茶树种质为材料的抗寒性研究也有报道，但仅局限于叶片解剖结构和低温胁迫下茶树叶片生理生化指标的变化等方面［3，10］，而对低温胁迫诱导下茶树特异基因的表达和茶树抗寒性分子机制的研究尚未见报道。为了更全面地发掘和了解陕西特有的茶树抗寒种质中的相关基因及其功能，作者利用DDRT-PCR技术，分析了经低温胁迫不同时间后抗寒茶树品种‘紫阳圆叶’基因差异表达的结果，并通过半定量RT-PCR验证差异表达基因的表达特性，以期揭示茶树抗寒性的分子机制，为通过基因工程技术提高中国北方茶区茶树的抗寒性奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为优良抗寒茶树品种‘紫阳圆叶’(‘Ziyangyuanye’)，取自陕西省安康市紫阳县茶叶试验站。锚定引物和随机引物为上海生工生物工程技术服务有限公司产品;DNaseⅠ (RNase-free)、MMLV反转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs和DL2000 Marker等购自宝生物工程(大连)有限公司。所用仪器为PTC-200 PCR仪和Sequi-Gen GT测序电泳仪(Bio-Rad)、Microfuge 22R离心机(Beckman Coulter)、Tanon-1600全自动凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)、NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计(Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 低温处理方法 挖取长势良好、无病虫害、株高约30 cm的2年生扦插苗，移栽至陕西师范大学遗传学实验室的人工气候箱(温度25℃、空气相对湿度65%)中培养，并按统一标准进行水肥管理。待茶树苗生长稳定后置于人工气候箱中于4℃进行低温处理，处理时间分别为0、8、12、24和48 h，每一处理组4株扦插苗，3次重复。低温处理结束后在扦插苗对应位置上取当年生新梢第2和第3枚真叶，迅速置于液氮中冷冻后，于-80℃冰箱中保存、备用。

1.2.2 总RNA提取和cDNA第1链合成 取冻存叶片约 500 mg，采用改良的 SDS-酸酚法［11］提取总RNA;用质量体积分数1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，并用超微量紫外分光光度计测定其纯度和浓度。反转录引物分别为 B0327、B0328和B0329(序列见表1)，以总RNA为模板，参照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)使用说明书合成cDNA第1链。

1.2.3 DDRT-PCR分析 以反转录合成的cDNA第1链为模板，用 3条锚定引物(B0327、B0328和B0329)与7条随机引物(B0305～B0311)(序列见表1)组成21个引物对组合，分别进行RT-PCR扩增反应，重复2次。扩增程序为:94℃预变性1 min;94℃变性30 s，45℃退火2 min，72℃延伸30 s，共40个循环;最后于72℃延伸10 min。取扩增产物4 μL，加入3 μL上样缓冲液于95℃变性5 min，冰浴3 min后用质量体积分数6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，拍照记录实验结果。

表1 用于茶树品种‘紫阳圆叶’基因DDRT－PCR的引物序列Table 1 Primer sequences used for DDRT-PCR of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’gene

1.2.4 cDNA差异片段的回收、测序及分析 挑选差异片段，采用煮沸法回收并二次扩增，所用的引物对组合及扩增条件与上述DDRT-PCR分析相同;扩增产物用质量体积分数1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选仅有1条扩增产物且与DDRT-PCR扩增结果长度一致的片段，交由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果经GenBank和EST等数据库BLASTn和BLASTx检索，分析同源性。

1.2.5 半定量 RT-PCR分析与验证 参照 Prime ScriptRT reagent Kit说明书反转录合成cDNA第1链。根据BLAST检索结果并采用Primer Premier 5.0软件设计相应引物，选择功能明确的差异片段进行半定量RT-PCR，扩增产物经质量体积分数1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果和分析

2.1 总RNA提取及检测结果

经质量体积分数1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，从经过4℃低温处理不同时间的茶树2年生扦插苗叶片中提取的总RNA的28S、18S和5S带型清晰、锐度好且无弥散(图1)。说明其总RNA较完整且无降解。用超微量紫外分光光度计测定吸光度(A)，结果显示:A260/A280为1.9 ～2.0，A260/A230大于 2.0，表明获得的RNA纯度较高，可以用作反转录反应的模板。

图1 低温(4℃)胁迫不同时间后茶树品种‘紫阳圆叶’叶片总RNA的电泳结果Fig.1 Electrophoresis result of total RNA of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’leaf after treated by low temperature(4℃)stress for different times

2.2 mRNA差异显示结果

在4℃低温条件下对茶树品种‘紫阳圆叶’2年生扦插苗分别处理0、8、12、24和48 h，对5个处理组扦插苗叶片的反转录产物进行DDRT-PCR扩增，其中部分引物对的扩增结果见图2。扩增结果显示:共有12个引物对扩增出有明显差异的cDNA片段。这些差异片段在低温胁迫条件下表现为2种类型:第1类为抑制表达片段，即随胁迫时间延长cDNA片段的强度呈减弱趋势，如差异片段DF-8(图2-A)和DF-2(图2-B);第2类为诱导表达片段，在处理的开始阶段(0 h)即表达但强度较弱，随低温处理时间延长这些片段的强度递增，至处理24 h后达到最强，如差异片段DF-3(图2-C)。

图2 经低温(4℃)胁迫不同时间后茶树品种‘紫阳圆叶’的部分DDRT－PCR扩增图谱Fig.2 A part of amplification pattern of DDRT-PCR of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’after treated by low temperature(4℃)stress for different times

2.3 差异片段的二次PCR扩增结果

通过上述DDRT-PCR扩增获得差异片段，对差异片段回收后进行二次PCR扩增，扩增产物的电泳检测结果显示(图3):差异片段DF-8、DF-2和DF-3的二次PCR扩增产物均为1条片段，且分子量与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中一致。说明3条差异片段均为阳性。

图3 经低温(4℃)胁迫不同时间后茶树品种‘紫阳圆叶’差异片段的二次PCR扩增图谱Fig.3 Amplification pattern of the second PCR of differential fragments of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’after treated by low temperature(4℃)stress for different times

2.4 差异片段测序结果及同源性比对

差异片段DF-8、DF-2和DF-3经测序并通过BLASTn进行同源性比对，结果表明:差异片段DF-8长度为217 bp，与多个茶树品种的谷氨酰胺合成酶基因片段有很高的同源性，与‘安吉白茶’(Camellia sinensis‘Anjibaicha’)和‘龙井 43’(C.sinensis‘Longjing 43’)的谷氨酰胺合成酶基因的同源性分别为96%和91%;与茶树谷氨酰胺合成酶基因、‘安吉白茶’谷氨酰胺合成酶基因、茶树细胞质谷氨酰胺合成酶基因和‘龙井43’细胞质谷氨酰胺合成酶基因的同源性序列mRNA的期望值分别为1e-76、7e-75、3e-28和2e-26;故以“茶树谷氨酰胺合成酶基因片段(Csgsf，Camellia sinensis glutamine synthetase fragment)”命名。相关序列同源性的BLASTx比对结果显示:Csgsf与多种植物谷氨酰胺合成酶基因高度同源，与菜豆(Phaseolus vulgaris Linn.)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)、油棕(Elaeis guineensis Jacq.)、西 洋 参 (Panax quinquefolius Linn.)和 水 稻(Oryza sativa Linn.)谷氨酰胺合成酶基因的同源性分别达到100%、97%、97%、97%和93%，因此推测该片段即为‘紫阳圆叶’谷氨酰胺合成酶基因片段。

差异片段DF-2和DF-3的碱基数分别为316和232 bp，均为低温胁迫下差异表达的片段，故命名为“茶树冷诱导基因片段(Cscaf，Camellia sinensis cold acclimation fragment)”，分别用Cscaf1和Cscaf2表示。EST数据库的检索结果显示:Cscaf2与茶树干旱胁迫诱导表达的cDNA的同源性为100%，与茶树干旱抑制消减杂交文库保守假定蛋白相似cDNA(CsSSHFD946)和茶树干旱抑制消减杂交文库未命名蛋白相似cDNA(CsSSHFD600)的期望值分别为1e-106和1e-101;而Cscaf1未能检出同源序列，推测其为与冷胁迫相关的未知基因。

2.5 半定量RT－PCR结果

选择经4℃低温胁迫后茶树叶片的下调表达片段Csgsf和Cscaf1及上调表达片段Cscaf2进行RTPCR验证。结果见图4。由图4可见:Csgsf和Cscaf1在胁迫初始即表达，并随着低温胁迫时间的延长表达量逐渐降低;而Cscaf2在0 h表达较弱，随着低温胁迫时间的延长表达量逐渐增加，在胁迫48 h后达到最大。

图4 经低温(4℃)胁迫不同时间后茶树品种‘紫阳圆叶’差异片段Csgsf、Cscaf1和Cscaf2的半定量RT－PCR结果Fig.4 Semi-quantitative RT-PCR result of differential fragments Csgsf，Cscaf1 and Cscaf2 of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’after treated by low temperature(4℃)stress for different times

3 讨 论

本研究采用mRNA差异显示技术，对陕西地方抗寒性茶树种质‘紫阳圆叶’在5个不同时间段低温胁迫处理下的cDNA进行分析，并通过差异cDNA片段的克隆、测序和功能分析，最终获得3个与低温胁迫相关的片段，分别为谷氨酰胺合成酶基因片段Csgsf和在低温胁迫下表现应答的茶树冷诱导基因片段Cscaf1和 Cscaf2。

谷氨酰胺合成酶(GS)为高等植物氨同化的关键酶。当ATP供能时，GS将催化还原为谷氨酰胺。GS的表达受组织器官特异性以及光照、温度、盐离子、土壤重金属、水分胁迫及氮源形式等因素的影响［12-13］。Teixeir等［14］的研究结果表明:经盐胁迫处理后，马铃薯(Solanum tuberosum Linn.)叶片中的 GS表达下调，根部的GS表达上调，说明盐胁迫对马铃薯各器官中的GS含量有影响，其中叶片中的GS对盐胁迫的敏感性较根部更强。此外，低温也会明显影响植物GS等氮素同化酶的活性。陆彬彬等［15］的研究结果表明:相对低温会抑制水稻叶片中GS的活性;本研究结果也显示:在低温胁迫过程中Csgsf强度随胁迫时间延长逐渐变弱;在低温胁迫处理过程中的前8 h，Csgsf表达活性较高，但随胁迫时间的延长，至胁迫16 h时其表达量明显下降。据此可推测:低温胁迫过程中茶树叶片中谷氨酰胺合成酶基因的表达量随胁迫时间的延长逐渐降低，呈下调趋势，这与 Rana等［16］对4℃低温处理后茶树叶芽中GS的表达状况的研究结果一致。Rana等［16］的研究结果还表明:GS除对低温胁迫有响应外，在经过干旱和高温等非生物因子胁迫处理后，茶树叶芽中GS的表达量也均下调。推测茶树GS基因启动子区域可能有胁迫响应元件，从而导致基因表达量降低。

大多数植物叶片中包含2类GS，即胞液型GS(GS1)和叶绿体型GS(GS2)，其中GS1主要同化内源性蛋白质降解和氨基酸分解代谢产生的氨［17］。本研究结果和Rana等［16］的研究结果均表明:经低温胁迫后茶树叶片中的GS表达均减弱。其原因可能是:在温度下降后叶片细胞中蛋白质分解代谢和光呼吸作用均减弱，导致内源性蛋白质和由光呼吸产生的均减少，进一步引起GS表达量下调、酶活性下降。相关的具体生化途径和基因表达调控机制尚待进一步深入研究。

干旱胁迫与低温胁迫对植物生理生化过程以及基因表达等的影响作用相似［18］，植物抗寒相关基因包括冷胁迫专一诱导基因和低温诱导基因，其中，专一诱导基因只能被冷处理诱导［19］，而低温诱导基因不仅能对低温处理快速应答还能被水胁迫、短日照和ABA等胁迫诱导，如拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕的 RC12A 和 RC12B 等基因［20］。本研究中，茶树冷诱导基因片段Cscaf2与茶树干旱胁迫诱导下表达的cDNA同源性高达100%，由此可推测Cscaf2是对干旱和低温等胁迫均有表现应答的基因片段。在基因数据库中未能检出茶树冷诱导基因片段Cscaf1的同源序列，推测其可能是与冷胁迫相关的基因片段，具体功能还有待进一步研究。

低温是影响茶树生长发育、制约茶叶产业发展的最重要的非生物因子之一。陕西地方茶树品种主要种植于秦巴山区，因长期适应低温环境，比南方种植的茶树品种的抗寒性相对更强。由于差异显示技术的局限性，本研究未能从抗寒茶树品种‘紫阳圆叶’中克隆获得与茶树抗寒直接有关的基因。但根据研究结果并结合相关文献，Csgsf、Cscaf1和Cscaf2这3个cDNA片段的确参与了茶树对低温胁迫的应答，这3个片段的获得不仅有助于茶树抗寒性分子机制的深入研究，也为今后地方优良茶树种质资源的合理利用以及遗传改良奠定了一定的研究基础。

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