Photofrin-Ⅱ在食管癌细胞系内吸收的研究

丁凯利，李 娜，张梦曦，李璞玉，李硕果

食管癌是常见的消化道肿瘤之一，目前尚缺乏有效的早期诊断方法，大多数患者确诊时已处于中、晚期，对于不能耐受手术、放疗、化疗等的病人尚无有效治疗措施。光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)是一种治疗食管癌的新技术，PDT的基础是光敏剂能在肿瘤组织中聚集，关于光敏剂在肿瘤组织聚集的机制尚不完全清楚。本实验通过高效液相色谱法测定人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC内photofrin-Ⅱ的浓度，探讨肿瘤细胞对光敏剂的亲和力度。

1 材料与方法

1.1对象人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC[1-3](由汕头大学医学院许丽艳教授惠赠)。

1.2主要试剂及仪器光敏剂photofrin-Ⅱ(加拿大Sinclair Pharmaceuticals公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/F12培养基、PBS液(美国GIBCO公司)；CO2培养箱(日本SANYO公司产品)；倒置生物显微镜(日本NIKON公司产品)；超净工作台(江苏苏州净化设备公司)；80-2型离心机(江苏常州手术器械厂)；Agilent 1100 系列高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.3SHEE及SHEEC的培养、传代SHEE及SHEEC在含10%小牛血清的DMEM/F12细胞培养液中培养，于37℃、5%CO2培养箱中常规细胞培养、传代。

1.4实验分组及处理分别取处于指数生长期的SHEE及SHEEC，0.25%胰蛋白酶消化，配制成1.0×105个/mL细胞悬液，接种于6孔细胞培养板，每孔1 mL。置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h，将细胞系SHEE及SHEEC分别随机分成13组，每组3复孔，PBS液冲洗3遍。处理后的13组细胞系SHEE及SHEEC在避光条件下更换为不含胎牛血清的DMEM/F12液配制的光敏剂photofrin-Ⅱ，光敏剂最终浓度分别为0、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养120 min后，取出培养板，用PBS冲洗3遍。采用胰蛋白酶消化法消化细胞，每孔加入0.25%的胰蛋白酶0.5 mL，置于7℃、5%CO2恒温培养箱中充分消化后置入5 mL离心管中，离心5 min，转速1 500 r/min，后在冰浴超声中破碎细胞(功率400 W，作用时间3 s，间隔时间4 s，3次循环)，待细胞破碎后离心，取上清液，加入高效液相色谱仪测定SHEE细胞和SHEEC细胞内光敏剂Photofrin-Ⅱ的含量，探索SHEE和SHEEC细胞对光敏剂Photofrin-Ⅱ不同浓度的吸收规律。

1.5色谱仪器及条件所有实验均在室内温度完成，ZORBAX SB-C18色谱柱，SB-C18保护柱，流动相：乙腈-水-0.1%TFA=45∶35∶20(V/V/V)；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；检测波长：400 nm。经超声破碎后的细胞，于高速离心机中离心，12 000 r/min，10 min，吸取上清，0.22 μm孔径滤膜过滤，准确吸取待测混悬液样品1.0 mL于10 mL具塞试管中，加入1 mol/L的NaOH 200 μL，充分摇匀。再加入乙酸乙酯3.0 mL，漩涡混合2 min后静置30 min分层，转移上层有机相于另一锥底试管中，氮气流吹干。用200 μL 流动相复溶，取复溶液于自动进样器的样品瓶中，设定20 μL进样检测。

2 结果

人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC在浓度分别为0、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL的光敏剂photofrin-Ⅱ孵育5 h，测定细胞内光敏剂photofrin-Ⅱ浓度值，结果见表1。SHEE和SHEEC细胞经在含photofrin-Ⅱ的培养液中孵育5 h后对光敏剂photofrin-Ⅱ吸收有差异(t=2.053，P=0.024)，SHEEC比SHEE细胞吸收photofrin-Ⅱ量多。

表1 细胞系SHEE和SHEEC在photofrin-Ⅱ不同浓度下孵育5 h浓度值 μg

3 讨论

早期食管癌术后5 a生存率达90%，但一般病人就诊已属于中晚期，能手术治疗者仅为20%，术后5 a生存率为30%，晚期放疗的5 a生存率不到10%，单用化疗效果不佳，说明了食管癌早诊断和早治疗的必要性，加强手术与其他治疗手段综合治疗研究的必要性。PDT是近30 a新兴的治疗肿瘤的方法，很多研究发现光动力对食管癌有独特的疗效。

PDT是指在特定波长光的作用下，使机体内含光敏剂的组织细胞发生一系列化学生物变化的治疗方法。其机理是利用机体摄取光敏剂后一定时期内，光敏剂在肿瘤内形成相对高浓度时，予以一定波长的光照射肿瘤局部，激发氧分子产生氧化能力极强的活性单态氧及自由基来破坏肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。PDT的基础是肿瘤组织能选择性摄取光敏剂，病灶部位光敏剂浓度相对正常组织高，而关于光敏剂在肿瘤组织聚集的机制尚不完全清楚，目前大概有肿瘤细胞亲和力、血管亲和力学说两种假说。肿瘤细胞亲和力学说是指光敏剂能在肿瘤细胞中聚集，Kessel等发现光敏剂与LDL有独特亲和力，而肿瘤细胞LDL受体上调可能是光敏剂聚集的原因[4]；也可能与肿瘤细胞过度生长导致肿瘤细胞营养不良，缺少卟啉类物质有关。血管亲和力学说是由于肿瘤组织新生血管丰富，内皮间隙较大，血管的通透性比较高，光敏剂从内皮间隙大量泄漏，淋巴引流异常，导致光敏剂大量潴留[5]。

本课题组前期试验通过荧光分光光度仪测定SHEE及SHEEC对photofrin-Ⅱ的吸收排出规律，发现在一定时间内SHEE及SHEEC对photofrin-Ⅱ的吸收排出规律无明显差异[6]。但前期研究所采用的荧光分光光度仪法是利用photofrin-Ⅱ的荧光特性，测定SHEE 细胞和SHEEC细胞内光敏剂的荧光强度值，为相对值，并不能完全反映photofrin-Ⅱ的绝对值。本实验采取的高效液相色谱法，能直接测出photofrin-Ⅱ在SHEE 细胞和SHEEC细胞的绝对含量。

高效液相色谱法是指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法，是在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法，已在化学领域、药学领域、食品分析领域得到了广泛的应用。目前有关采用高效液相色谱法对卟啉类衍生物的分析分离的报道比较少见。雍政等[7]采用Waters510高效液相色谱仪，PolarlsCl8-A色谱柱，检测波长为390 nm，以甲醇∶水∶乙腈∶四氢呋喃为流动相，流速为1.5 mL/min，检测国产血卟啉注射液，发现该方法快速稳定、重复性好，能较好地用于测量该药物的含量。

本实验采用Agilent1100系列高效液相色谱仪，ZORBAX SB-C18色谱柱，流动相为乙腈-水-三氟乙酸，流速为1.5 mL/min，能较好地检测出photofrin-Ⅱ在细胞悬液中的含量。研究结果发现，细胞系SHEE及SHEEC在photofrin-Ⅱ中孵育5 h，SHEEC吸收Photofrin-Ⅱ的量较SHEE多，提示食管癌细胞系SHEEC对photofrin-Ⅱ有独特亲和力，这为进一步揭示光动力疗法的靶向治疗原理提供了基础。

参考文献：

[1] 沈忠英,岑山,蔡维佳,等.人乳头状瘤病毒18型E6E7基因诱导人胚食管上皮永生化[J].中华实验和临床病毒学杂志, 1999，13: 121-124.

[2] Shen ZY,Xu LY,Chen XH,et al.The genetic events of HPV-immortalized esophageal epithelium cells[J]. Int J Mol Med,2001,8: 537-524.

[3] 沈忠英,蔡维佳,沈健,等.人乳头状瘤病毒18型E6E7和TPA协同诱发人胚食管上皮细胞恶性转化的研究[J].病毒学报,1999,15:1-5.

[4] Kessel D.The role of low-density lipoprotein in the biodistribution of photosensitizing agents[J].Photochem Photobiol B,1992,14:261-262.

[5] Iyer AK,Greish K,Seki T,et al.Polymeric micelles of zinc protoporphyrin for tumor targeted delivery based on EPR effect and singlet oxygen generation[J].Drug Target，2007,15:496-506.

[6] Gao SG,Wang LD,Feng XS,et al.Absorption and elimination of photofrin-II in human immortalization esophageal epithelial cell line SHEE and its malignant transformation cell line SHEEC[J].Ai Zheng,2009,12:1248-1254.

[7] 雍政,何冰,王萧.国产血卟啉注射液的高效液相色谱质量检测[J].武警医学院学报,2011,20:964-965.