响应面法优化留胚精米中积累γ-氨基丁酸的发芽条件

华泽田，刘胜斌，王 芳，孟 梦，赵 飞，张 芹，宛红颖，谢艳辉

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457;2.国家粳稻工程技术中心，天津300457)

γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)是一种非蛋白质氨基酸，在动植物中广泛分布。它由L-谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化而来，是一种重要的抑制性神经递质［1］。GABA 有调节心血管［2］、调节神经相关蛋白及酶的表达［3］、降血压［4］、抗衰老［5］、促进生长素分泌［6-7］等功能，是一种很有研究前景的营养物质。目前，水稻中GABA含量的研究主要原料是糙米［8］，糙米的口感影响人们的消费。Z601是一种高留胚率的米，其精米留胚率在80%以上。本研究以Z601为原料，通过单因素实验，响应面实验研究精米中GABA含量与浸泡温度、浸泡时间、发芽温度、发芽时间4种发芽条件的关系，为留胚精米的综合利用和新产品的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

留胚米Z601 国家粳稻工程技术中心;γ-氨基丁酸 Sigma-Aldrich Co.LLC;三氯乙酸、次氯酸钠、醋酸钠 天津市北方天医化学试剂厂;甲醇(色谱纯)、乙腈 (色谱纯) Merck KGaA Darmstadt Germany;β-巯基乙醇 AMRESCO Inc;邻苯二甲醛 生工生物(上海)工程有限公司。

高效液相色谱仪LC-10ATVP 日本岛津公司;Venusil MP-C18色谱柱(4.6mm×250mm);TE214S电子天平 赛多科斯科学仪器有限公司;JGJ45糙米机

杭州钱江仪器设备公司;Pearlest精米机 日本KETT科学研究所;pHS-3C型pH计 天津盛邦科学仪器技术有限公司;HYG恒温摇床 上海欣蕊自动化设备有限公司;HK-02A粉碎机 广州旭朗机械设备有限公司;SHB-3型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;针式过滤器 天津博纳艾杰尔科技有限公司;一次性使用无菌注射器(1mL) 上海治宇医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 精米发芽工艺条件及操作要点 工艺流程:原料筛选→去皮成糙米→磨成精米→消毒→清洗→发芽→干燥→粉碎［8］

操作要点:选取籽粒饱满的稻米，去皮后用Pearlest精米机处理40s成为精米。为了抑制发芽后的发酵味，用1%的次氯酸钠水溶液洗1min，用灭菌的去离子水反复冲洗3遍。将处理好的精米用纱布包好，恒温浸泡，转入培养皿中发芽，保持培养皿湿润，每3h上下翻动一次。发芽结束后将培养皿放入55℃烘箱终止活性，干燥一定时间，取出粉碎。

1.2.2 GABA含量测定 样品准备:将粉碎后的样品过60目筛，称取2g，加入5%三氯乙酸水溶液5mL，30℃振荡提取2h，离心(转速10000r/min)10min，取上清液待测［9］。

色谱条件:单泵，流速为0.9mL/min;色谱柱为Venusil MP-C18(4.6×250mm)，柱温30℃;流动相为1.6g NaAc·3H2O溶于 600mL水中，pH7.2，甲醇200mL，乙氰200mL;检测波长338nm。

衍生化［10］:吸取硼酸缓冲液(0.4mol/L，p H10.4)1000μL，样品 200μL，OPA 衍生试剂(OPA 80mg，β-巯基乙醇 80μL，乙腈 10mL)200μL，混合均匀，暗室中室温反应5min后进样20μL。

GABA标准曲线的绘制:用配制好的250mg/L的标准液分别稀释 50、40、30、20、10、6、5 倍，柱前衍生，吸取20μL进样，重复三次，以GABA的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3 实验设计

1.3.1 浸泡温度对γ-氨基丁酸含量的影响 将20g精米用一级水浸泡，浸泡温度分别为15、20、25、30、35、40℃，浸泡 10h，在 25℃条件下发芽 18h，取出干燥粉碎，分别测定GABA含量。

1.3.2 浸泡时间对γ-氨基丁酸含量的影响 将20g精米用一级水浸泡，浸泡温度分别为30℃，浸泡时间分别为 4、6、8、10、12、14、16h，在 25℃ 条件下发芽18h，取出干燥粉碎，分别测定GABA含量。

1.3.3 发芽温度对γ-氨基丁酸含量的影响 将20g精米用一级水浸泡，浸泡温度分别为30℃，浸泡12h，分别在 20、25、30、35、40℃条件下发芽 18h，取出干燥粉碎，分别测定GABA含量。

1.3.4 发芽时间对γ-氨基丁酸含量的影响 将20g精米用一级水浸泡，浸泡温度分别为30℃，浸泡时间分别为 12h，在 30℃ 条件下分别发芽 6、12、18、24、30h，取出干燥粉碎，分别测定GABA含量。

1.3.5 响应面实验各水平及编码 根据单因素实验的实验结果，设计响应面实验。各因素及编码见表1。

表1 Box-Behnken响应面设计各因素水平及编码Table 1 Variables and levels in response surface design

1.4 实验数据处理

采用Design-Expert软件(V8.0.6)对实验数据进行线性回归和方差分析，用F值考察模型和各因素的显著性水平，所有的实验均做3次重复，实验结果以干基表示。

2 结果与分析

2.1 留胚精米发芽结果

本实验组通过对157个水稻品种的精米留胚率进行统计，筛选出高留胚率的水稻品种Z601。普通的精米留胚率在50%以下，而Z601精米留胚率在80%以上。经过24h的发芽培养，糙米的出芽率接近100%，普通的精米不发芽，而Z601精米部分发芽(图1)，其发芽率达42%，为研究不同发芽条件对留胚精米中GABA积累的影响提供了可能。

图1 糙米、留胚精米和普通精米发芽处理前后对比图Fig.1 Brown rice，germ-remaining milled rice，common milled rice before and after germination

2.2 GABA标准曲线的绘制

为研究GABA标准品溶液浓度与液相色谱峰面积之间的线性关系，用液相色谱法测定不同浓度的GABA标准品溶液的峰面积，图2为GABA标准品的液相图，以信号峰面积为纵坐标(Y)，GABA浓度为横坐标(X)，结果线性回归得到回归方程(图3):Y=6227.9X+2177.3，R2=0.9995。GABA 最低检出限为5mg/L。

图2 GABA标品液相图Fig.2 Chromatogram of standard solution

2.3 单因素实验结果分析

图3 GABA标准曲线图Fig.3 Standard curve of GABA

为研究各个因素不同水平下GABA含量的变化规律，确定每个因素最佳的提取条件，对每个因素不同水平的GABA含量按照上述1.3.1～1.3.4所示的方法进行测定，得到以下结果，见图4。

图4 各因素对GABA含量的影响Fig.4 Individual effect on GABA content

在15～30℃范围内，随着浸泡温度的上升GABA含量逐渐上升，在30℃时达到最大值，30～40℃随着浸泡温度的上升GABA含量逐渐下降(图4a)。在4～12h范围内，随着浸泡时间的增加，GABA含量逐步增加，浸泡时间在12h时GABA含量达到最大值，12～16h范围内，随着浸泡时间的增加GABA含量逐渐下降(图4b)。在20～30℃范围内，随着发芽温度的上升GABA含量逐渐上升，在30℃时达到最大值，30～40℃随着发芽温度的上升GABA含量逐渐下降(图4c)。过高或者过低的温度都不利于GABA积累［12］，温度过低，种子发芽缓慢，GABA含量积累慢，温度过高，酶活性下降，GABA含量积累也会受到影响［13］。在6～24h范围内，随着发芽时间的增加，GABA含量逐步增加，浸泡时间在24h时GABA含量达到最大值，24～30h范围内，随着发芽时间的增加GABA含量逐渐下降(图3d)。随着发芽时间的增加GABA含量逐渐下降主要原因是在此过程中GABA在转氨酶的作用下变成了琥珀酸半醛［14］。

因此，各因素最佳的提取条件确定为:浸泡温度30℃，浸泡时间12h，发芽温度30℃，发芽时间24h。

2.4 响应面实验设计与结果分析

2.4.1 Box-Behnken实验方案及结果 按照Design-Expert软件(V8.0.6)设计的四因素三水平实验方案(表2)，测定不同发芽条件下精米中GABA含量(图5)，对实验数据进行线性回归和方差分析(表3)确定模型及各项的显著性水平。

图5 精米样品液相图Fig.5 Chromatogram of GABA in the sample

通过分析(见表2)得到GABA含量与各发芽条件之间的二次多项式模型为:

此模型的复相关系数R2=0.9946，模型极显著，失拟项在0.05水平上不显著(p＞0.05)。R2Adj=0.9893说明该模型能够解释98.93%响应值的变化，能描述GABA含量随发芽条件的变化规律。其中

X1、X2、X4、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X12、X22、X32、X42对 GABA 含量影响极显著，X3、X1X2、X3X4对 GABA含量影响不显著(表3)。所以GABA含量与各发芽条件之间的二次多项式模型修正为:

2.4.2 两因素之间的交互作用 由以上得出的模型可以做出响应面图和等高线图(图6～图11)，各因素及其交互作用对响应值的影响可以通过组图直观的表现出来。等高线图反映了交互作用的强弱［15］，通过分析等高线图可以得出每两个因素中对GABA含量影响较大的因素。

表2 响应面实验方案及结果Table 2 Process variables and levels in response surface central composite design and experimental results

表3 模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regressionmodel

图6 浸泡温度(X1)与浸泡时间(X2)对GABA含量影响的响应面图及等高线图Fig.6 Response surface showing the interactive effects of soaking temperature and time on GABA content

浸泡温度不变时，随着浸泡时间的延长，GABA含量先升高后下降;当浸泡时间不变时，随着浸泡温度的上升GABA含量先升高后下降(图6)。说明过高的浸泡温度和浸泡时间都不利于GABA含量的积累。

浸泡温度不变时，随着发芽温度的升高，GABA含量先升高后下降;当发芽温度不变时，随着浸泡温度的上升GABA含量先升高后下降(图7)。说明过高的浸泡温度和发芽温度都不利于GABA含量的积累。浸泡温度等高线比发芽温度等高线陡峭，说明浸泡温度对GABA含量影响比发芽温度对GABA含量影响要大。

图7 浸泡温度(X1)与发芽温度(X3)对GABA含量影响的响应面图及等高线图Fig.7 Response surface showing the interactive effects of soaking temperature and germination temperature on GABA content

浸泡温度不变时，随着发芽时间的延长，GABA含量先升高后下降;当发芽时间不变时，随着浸泡温度的上升GABA含量先升高后下降(图8)。说明过高的浸泡温度和发芽时间都不利于GABA含量的积累。浸泡温度等高线比发芽时间等高线陡峭，说明浸泡温度对GABA含量影响比发芽时间对GABA含量影响要大。

浸泡时间不变时，随着发芽温度的升高，GABA含量先升高后下降;当发芽温度不变时，随着浸泡时间的延长GABA含量先升高后下降(图9)。说明过高的浸泡时间和发芽温度都不利于GABA含量的积累。浸泡时间等高线比发芽温度等高线陡峭，说明浸泡时间对GABA含量影响比发芽温度对GABA含量影响要大。

图8 浸泡温度(X1)与发芽时间(X4)对GABA含量影响的响应面图及等高线图Fig.8 Response surface showing the interactive effects of soaking temperature and germination time on GABA content

图9 浸泡时间(X2)与发芽温度(X3)对GABA含量影响的响应面图及等高线图Fig.9 Response surface showing the interactive effects of soaking time and germination temperature on GABA content

浸泡时间不变时，随着发芽时间的延长，GABA含量先升高后下降;当发芽时间不变时，随着浸泡时间的延长GABA含量先升高后下降(图10)。说明过高的浸泡时间和发芽时间都不利于GABA含量的积累。浸泡时间等高线比发芽时间等高线平缓，说明浸泡时间对GABA含量影响比发芽时间对GABA含量影响要小。

图10 浸泡时间(X2)与发芽时间(X4)对GABA含量影响的响应面图及等高线图Fig.10 Response surface showing the interactive effects of soaking time and germination time on GABA content

发芽温度不变时，随着发芽时间的延长，GABA含量先升高后下降;当发芽时间不变时，随着发芽温度的上升GABA含量先升高后下降(图11)。说明过高的发芽温度和发芽时间都不利于GABA含量的积累。

2.4.3 验证性实验 经过分析，对Z601精米GABA含量最有利的工艺条件为:浸泡温度31.02℃、浸泡时间12.69h、发芽温度30.63℃、发芽时间27.12h，GABA含量预测值可达到31.54mg/100g。为了实验操作简便此发芽工艺条件调整为浸泡温度31℃、浸泡时间13h、发芽温度31℃、发芽时间27h。按照调整后的条件进行测定，最终测定的结果为31.13mg/100g，与预测值接近。证明了此模型对优化精米中GABA含量发芽条件的可行性。

图11 发芽温度(X3)与发芽时间(X4)对GABA含量影响的响应面图及等高线图Fig.11 Response surface showing the interactive effects of germination time and temperature on GABA content

3 结论

本研究通过单因素实验，响应面实验及验证性实验得到了GABA含量与浸泡温度、浸泡时间、发芽温度、发芽时间回归模型:

Y=-510.10+21.69X1+19.69X2+1.48X4+0.08X X+0.04X X+0.18X X+0.20X X-0.40X2131423241-1.16X22-0.15X32-0.11X42确定了对GABA含量最有利的发芽工艺条件为浸泡温度31℃、浸泡时间13h、发芽温度31℃、发芽时间27h，此条件下测定的结果为31.13mg/100g，是不发芽条件下精米中GABA含量(7.8mg/100g)的4倍，与预测值接近。说明了此模型的可行性。目前，国内外对稻米中的GABA含量研究主要集中在糙米，对精米中的GABA含量研究鲜有报道，精米比糙米有更强的适口性，因此本研究以留胚精米为原料，为留胚精米新产品的开发提供了理论依据。

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