海水小球藻中脂类物质的成分分析及其抗菌活性研究

肖 艳，牛荣丽

(华侨大学分子药物研究院，福建厦门361021)

海洋微藻是海洋生态系统中最主要的初级生产者，它具有种类多、数量大、繁殖快等特点，在保健食品、药物、化妆品、生物农药、污水治理等方面有广泛的应用，逐步成为人们关注的热点［1］。近年来从海洋微藻中分离提取出多种生物活性物质［2］，如从小球藻中提取得到的耐高温球蛋白和单半乳糖基二酰基被证明有抗肿瘤作用。对海洋微藻中的抗菌活性物质研究发现，部分脂肪酸及其酯类衍生物有抗菌活性［3-6］，如EPA(二十碳五烯酸)对食品腐败菌有一定的抗菌活性［7］，但是EPA甲酯的抗菌活性几乎无报道。本文利用多种提取分离方法，从海洋微藻小球藻中得到EPA甲酯，并将得到的EPA甲酯成分与其他脂肪酸甲酯进行抗菌实验研究，发现其抗菌活性最好，并对多种菌表现出抗菌活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海水小球藻粉 盘锦光合蟹业有限公司提供;金黄色葡萄球菌(ATCC6538P)、大肠杆菌(ATCC8739) 实验室冻存菌种;枯草芽孢杆菌(10275)、铜绿假单胞菌(10204) 购自中国微生物菌种保藏管理中心;琼脂、酵母提取物、蛋白胨 生化试剂;氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、尿素 购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯;EPA甲酯标准品，纯度≥99% 美国NU-CHEK公司。

GC-6890色谱仪 美国安捷伦公司;GC-MSQP2010联用仪 日本岛津公司;高压蒸汽灭菌锅ZEALWAY;MAXO400摇床 Thermo scientific;HPX-9082 MBE数显电热培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-IFD洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;旋转蒸发器 上海申胜生物技术有限公司。

1.2 粗脂的提取

取小球藻粉 10g，用氯仿∶甲醇(2∶1，V/V)混合液75mL，于4℃冰箱中浸提16h，过滤，回收溶剂得到浸膏。浸膏中加入50mL 0.88%NaCl水溶液，于分液漏斗中摇匀静置分层，用圆底烧瓶收集下层有机相，40℃旋转蒸发，得到粗脂。

1.3 多不饱和脂肪酸(PUFA)的分离

采用皂化-尿素包合的方法，取上步制得的粗脂，加入40mL 1mol/L NaOH-乙醇，在60℃水浴下皂化1h，室温冷却，过滤除皂，用6mol/L HCl调至pH至1～2，将得到的皂化液加入20mL的正己烷萃取三次，静置分层，合并有机相，旋转蒸发得到游离的脂肪酸。取游离脂肪酸，按脂肪酸∶尿素∶甲醇 =1∶3∶9(W/W/V)比例进行实验。尿素与甲醇于70℃封塞旋转溶解，然后迅速加入脂肪酸，冷却至室温后，于4℃下包合24h。将上述冷却结束后的尿包样品，用布氏漏斗迅速抽滤，收集滤液移入分液漏斗中，加入30mL去离子水，分别用20mL的正己烷萃取三次，静置分层，合并有机相，旋转蒸发得到多不饱和脂肪酸。

1.4 脂肪酸甲酯的制备

将制得的脂肪酸放入250mL圆底烧瓶中，再加30mL 3N盐酸-甲醇充分混合，加入几粒沸石，连接回流装置，在充氮气的条件下，70℃加热回流1h;然后取出冷却，移入分液漏斗，加入20mL蒸馏水，用10mL正己烷萃取，重复2次，合并有机相，加无水Na2SO4脱水后抽滤，然后40℃水浴中旋转浓缩，残液为其脂肪酸甲酯，于4℃冰箱放置，进样前用正己烷稀释到100mg/kg左右，精密量取1μL注入气质联用色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算各个脂肪酸的含量。

1.5 多不饱和脂肪酸甲酯的纯化

称取1g上述脂肪酸甲酯粗品，加入硝酸银-硅胶层析柱中［8］，依次用 1%、5%、10%、16%、22%、26%、30%丙酮-正己烷混合溶液两个柱体积进行洗脱，控制洗脱流速1mL/min，并每10mL收集1次洗脱液，经TLC分析，相同部分合并，再经气质联用色谱测定EPA甲酯的含量。

1.6 GC及GC－MS条件

GC条件:Agilent 19091N-113毛细管柱(30m×0.32mm ×0.25μm)，进样口温度 250℃，压力 10.19psi，分流比 40∶1，程序升温，从 150℃开始保持 1min，以15℃/min升至200℃，再以2℃/min升至230℃，保持0min。检测器温度275℃。H2流量4.5mL/min，空气流量400mL/min，N2流量1.5 mL/min。

GC-MS条件:Rtx-Wax毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm);载气:高纯氦气;测定条件:面积归一化法，进样口温度220℃，程序升温，从150℃开始保持1min，以15℃/min升至200℃，再以2℃/min升至230℃，保持6min。压力为72.0kpa，分流比为20∶1。质谱条件:EI离子源，离子源温度为220℃，接口温度250℃。检测器电压1.2kv，溶剂延迟2min，扫描范围45～350。

1.7 抗菌实验

采用圆形纸片［9］定性实验测得各脂肪酸甲酯的抑菌圈和试管稀释法［10］定量实验测得最小抑菌浓度(MIC)。

2 结果与讨论

2.1 GC及GC－MS结果

用气相色谱进行定性分析。如图1所示EPA甲酯标准品的Rf为10.368。将得到的粗脂、多不饱和脂肪酸及EPA分别进行甲酯化后，进行气相分析，如图2～图4所示。经过各步的提取分离纯化以后，EPA甲酯的纯度在不断增加，最后得到EPA甲酯的纯度可达到98.2%。

图1 EPA甲酯标准品气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of EPA methyl ester

图2 粗脂甲酯气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of fatty acid methyl ester

图3 尿包后多不饱和脂肪酸甲酯气相色谱图Fig.3 Gas chromatogram of Polyunsaturated fatty acid methyl ester

图4 过柱后EPA纯度为98.2%气相色谱图Fig.4 After through the column the purity of EPA methyl ester is 98.2%

用气质联用色谱仪，对所得到的3种脂肪酸甲酯进行成分和含量分析，如表1所示。粗脂甲酯中含有9种脂肪酸甲酯，其中十六烷酸的含量最高，其次是十六烷烯酸。经过尿素包合处理后，多不饱和脂肪酸的含量增多，不饱和脂肪酸的含量降低，其中EPA甲酯的含量达到30.20%。

表1 各步中脂肪酸组成及相对含量(%)Table 1 Composition and relative content of fatty acid on each step experiment(%)

2.2 抗菌实验结果

从图5可以看出，3种脂肪酸甲酯对大肠杆菌和绿脓杆菌没有明显的抑菌圈，对枯草杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑菌圈。粗脂甲酯的抑菌效果要弱于PUFA甲酯和EPA甲酯的抑菌效果。这与文献［11］报道的海藻提取物对革兰氏阳性菌的抑菌效果要强于革兰氏阴性菌相似。

图5 3种脂肪酸甲酯分别对大肠杆菌、绿脓杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果Fig.5 Effect of three fatty acid methyl esters on viability of Escherichia coli，Pseudomonas aeruginos，Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus

由表2可以看出，粗脂甲酯和PUFA甲酯对枯草杆菌的抑菌效果最好，MIC值分别为3.594mg/mL和0.831mg/mL。EPA甲酯对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC为0.692mg/mL。

3 结论

3.1 海水小球藻是一种天然保健食品，经研究测定，其含有蛋白质50%，脂肪酸15%～20%。EPA是一种人体内不能合成的必需脂肪酸，在人体中具有重要的生物学意义。文中采用了GC-MS技术对小球藻中脂肪酸的种类和含量进行了测定，并通过提取分离纯化得到EPA甲酯的纯度为98.20%。为其工业化生产提供了一定的实验依据。

表2 脂肪酸甲酯的抑菌实验结果(mg/mL)Table 2 Antibacterial activity of fatty acid methyl esters(mg/mL)

3.2 定性和定量的抗菌实验表明，脂肪酸甲酯成分对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌具有一定的抑制和杀灭作用，且对革兰氏阳性菌的效果要好于革兰氏阴性菌。脂肪酸甲酯成分中EPA甲酯的抑菌效果要好于粗脂甲酯和PUFA甲酯，这说明纯度越高的EPA甲酯抑菌效果越好。因此，今后可以选用与EPA甲酯相似的其他多不饱和脂肪酸甲酯进行抗菌研究。

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