白花蛇舌草挥发油对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用

王丽丽 ，林 婧 ，蔡巧燕 ，詹友知 ，陈达鑫 ，彭 军

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州350122）

原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌）是最常见的原发性肝肿瘤，发病率居全球恶性肿瘤的第5位，病死率居第3位［1］。白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd，HDW）的全草，其主要化学成分有熊果酸、免疫多糖、乌索酸、白花蛇舌草素等，具有增强免疫活性、抗氧化和抗肿瘤活性，现广泛用于治疗各种炎症和肿瘤［2-6］。白花蛇舌草挥发油主要成分为十六酸，亚油酸，9-十八碳烯酸，龙脑，6，10，14-三甲基-2-十五烷酮，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等［7-8］。目前国内外均未见其抗肿瘤活性的相关报道。本文对白花蛇舌草挥发油对肝癌HepG2细胞活性进行了研究，为其临床应用提供依据。

1 材 料

1.1 材料与细胞株 白花蛇舌草购自福建中医药大学国医堂；肝癌HepG2细胞细胞株均购自上海中科院细胞库。

1.2 试剂 DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自Hyclone公司；MTT购自Sigma公司。

1.3 主要仪器 CO2培养箱（Heal Force），ELX800酶标仪（BioTek），IX70荧光倒置相差显微镜（Olympus）。

2 方 法

2.1 白花蛇舌草挥发油的制备 取白花蛇舌草样品200 g，粉碎成粗粉，过40目筛，称量200 g，加入2 000 mL水，浸泡10 h，按《中华人民共和国药典》2005年版附录挥发油测定法，回流提取6 h，采用乙醚做吸收溶剂，乙醚用量为5 mL，得挥发性成分乙醚提取液，加入无水硫酸钠，得无水挥发油（0.09%），得到的油用DMSO超声溶解，配置成200 mg／mL溶液，4℃保存备用。

2.2 细胞培养 HepG2细胞经含10%胎牛血清DMEM 培养基（含 100 U／mL青霉素和 100 μg／mL链霉素）培养，置37℃，5%CO2培养箱进行传代培养。

2.3 MTT法检测细胞活力 取对数生长期细胞，进行细胞计数，HepG2以4×105个／mL接种于96孔板中，接种体积为 100 μL／孔，置 37℃，5%CO2培养箱培养，至细胞贴壁，且覆盖率达60%时，分别加入62.5、125、250、500、1 000 μg／mL 的白花蛇舌草挥发油，24 h后吸取各孔溶液，每孔加入100 μL的0.5 mg／mL MTT 溶液，37℃培养 4 h。4 h后，小心吸去孔内液体。往每孔内加入100 μL DMSO，振荡10 min后，在570 nm处测OD值。计算细胞活力，方程如下：

细胞活力（%）＝［实验组A值／对照组A值］×100%。

2.4 细胞形态学观察 人肝癌细胞HepG2经不同浓度的白花蛇舌草挥发油提取物干预24 h后，置于倒置显微镜下观察，并拍照。

2.5 统计学分析 所有数据应用Excel 2003和DPS v6.55软件进行分析处理，实验数据用表示，组间比较采用单因素方差分析。

3 结 果

3.1 白花蛇舌草挥发油提取物对HepG2细胞活力的影响 白花蛇舌草挥发油提取物对肝癌HepG2细胞生长存在明显的抑制作用，并且随浓度的加大而增大，与空白组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。IC50值为 369.3 μg／mL，结果见图 1。

图1 白花蛇舌草挥发油提取物对HepG2细胞活力的影响

3.2 白花蛇舌草挥发油提取物对HepG2细胞形态的影响 在倒置显微镜下观察可以看出：对照组的HepG2细胞生长良好，主要以近圆形和梭型2种形态存在，核仁清晰，胞质均匀，细胞舒展拉伸。而随着给药剂量的增加，悬浮的死细胞数量增多，贴壁细胞数量则显著下降，细胞形态发生明显变化，胞质、核仁逐渐固缩，细胞体积变小，变圆，在显微镜下可看到胞内空泡变多。结果表明：白花蛇舌草挥发油对人肝癌细胞HepG2的生长有明显的抑制作用且呈现显著的剂量依赖性，见图2。

图2 白花蛇舌草挥发油对HepG2细胞形态的影响（200×）

4 讨 论

肝癌与胃癌、肺癌等其它实体瘤有明显的不同，肝功能恶化和肝硬化的合并症一直是肝癌患者的主要死因之一。因此，在肝癌的治疗过程中，必须保护肝功能和机体的免疫机制［9］，但是目前的抗肿瘤药物的毒副作用大而且容易产生耐药性，因而治疗效果不理想。天然中药具有疗效广泛，毒副作用相对较小，作用效果明显等优势［10-12］。挥发油成分多是小分子物质，能被机体快速吸收，作用广泛，且多具芳香开窍、引药上行的功用，在心脑血管系统、中枢神经系统、呼吸系统、胃肠道系统、抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、促进药物吸收等多方面都具有功效。

白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草的全草，具有增强免疫活性、抗氧化和抗肿瘤活性，现广泛用于治疗各种炎症和肿瘤［13－14］。其挥发油主要成分为十六酸，亚油酸，9-十八碳烯酸，龙脑，6，10，14-三甲基-2-十五烷酮，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等。本研究采用白花蛇舌草的挥发油，探讨其对人肝癌HepG2细胞的影响。研究发现，白花蛇舌草挥发油干预后，人肝癌HepG2细胞密度明显减少，细胞变小，且对HepG2细胞的细胞活力也有显著的抑制作用，并呈现明显的剂量依赖性，表明白花蛇舌草挥发油对人肝癌HepG2细胞有明显的抑制作用。

［1］SIEGEL R，NAISHADHAM D，JEMAL A.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［2］叶榕，林久茂，魏丽慧，等.白花蛇舌草乙醇提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖及Hedgehog信号传导通路表达的影响［J］.海峡科学，2012，6（8）：100-102.

［3］魏丽慧，林久茂，彭军，等.白花蛇舌草乙醇提取物对人结肠癌细胞HT-29 Pim-1和Pim-2 mRNA表达的影响［J］.世界中西医结合杂志，2011，6（4）：284-287.

［4］CAI Q Y，LIN J M，WEI L H，et al.Hedyotis Diffusa Willd inhibits colorectal cancer growth in vivo via inhibition of STAT3 signaling pathway［J］.International Journal of Molecular Sciences，2012，13（5）：6117-6128.

［5］LIN J M，CHEN Y Q，WEI L H，et al.Hedyotis Diffusa Willd extract induces apoptosis via activation of the mitochondrion-dependent pathway in human colon carcinoma cells［J］.Int J Oncol，2010，37（5）：1331-1338.

［6］彭军，林久茂，魏丽慧.白花蛇舌草提取物对结肠癌HT-29细胞bcl-2和bax表达的影响［J］.福建中医学院学报，2010，20（5）：23-26.

［7］刘志刚，罗佳波，陈飞龙.不同产地白花蛇舌草挥发性成分初步研究［J］.中药新药与临床药理，2005，16（2）：132-134.

［8］王丽，周诚，麦惠珍.白花蛇舌草及水线草挥发性成分分析［J］.中药材，2003，26（8）：563-564.

［9］王昌俊.中药介入治疗原发性肝癌现状与展望［J］.中国中医药信息杂志，2002，9（9）：84-88.

［10］LEE M Y，LIN H Y，CHENG F，et al.Isolation and characterization of new lactam compounds that inhibit lung and colon cancer cells from adlay（Coix lachryma-jobi L.var.ma-yuen Stapf）bran［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46（6）：1933-1939.

［11］CHEN H H，CHIANG W C，CHANG Y Y，et al.Kuo.Antimutagenic constituents of adlay（Coix lachryma-jobi L.var.ma-yuen Stapf） with potential cancer chemopreventive activity［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（12）：6444-6452.

［12］LI S C，CHEN C M，LIN S H，et al.Effects of adlay bran and its ethanolic extract and residue on preneoplastic lesions of the colon in rats［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2011，91（3）：547-552.

［13］朱立俏.白花蛇舌草的化学成分和抗肿瘤活性的研究进展［J］.化工时刊，2012，26（10）：37-41.

［14］孙岩，李洁.白花蛇舌草抗肿瘤作用的研究进展［J］.食品与药品，2012，14（5）：210-213.