大鼠肝微粒体中钩吻素子UPLC-MS／MS法测定与酶促反应动力学研究

李 彧，曾荣洁，郑雪卿，郭陈建忠

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

钩吻为马钱科钩吻属植物钩吻Gelsemium elegans（Gardn.et Champ.） Benth.全草，是世界闻名的剧毒植物，盛产于闽、粤、桂等地［1］。化学成分研究表明：钩吻含有生物碱、环烯醚萜、三萜及苯丙素类等化合物；其中吲哚类生物碱是其主要活性成分，也是其毒性成分，目前共有将近70种生物碱从该植物中被分离得到［2-6］。药理实验表明：钩吻总生物碱具有显著的镇痛作用，但是治疗量却与中毒量较接近［7］，因此大大限制了临床的广泛应用。同时钩吻还具有抗肿瘤、调节免疫等作用［8］。钩吻素子是从钩吻中分离得到的一种Koumine型吲哚类生物碱，具有多种生理药理活性，如抗炎，镇痛，抗肿瘤，调节免疫功能，治疗银屑病以及抗血小板聚集作用等［9-11］。然而有关钩吻素子的体内外代谢与药动学研究尚未见报道。因此，本实验通过检测钩吻素子在大鼠肝微粒体中孵化反应后钩吻素子的剩余量来研究它的酶促反应动力学，寻找最优孵化体系，为该化合物的代谢酶谱鉴定提供前提条件，同时也为进行该药材的毒性与代谢相关性研究奠定实验基础。

1 实验材料

1.1 仪器 Waters ACQUITY UPLC-MS／MS超高效液相色谱-质谱联用仪（Waters，Milford，USA）；HCG-24A氮吹仪（天津恒奥科技发展有限公司）；H2050R-1台式高效冷冻离心机（湖南湘仪公司）；DAIHAN／VM-10涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器公司）；FA1004精密电子天平（上海衡平仪器仪表厂）。

1.2 试药 钩吻素子（上海中药标准化研究中心提供，批号：20120227）；钩吻碱甲（上海中药标准化研究中心提供，批号：20120227）；氯化镁（MgCl2）（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20111220）；葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）（Sigma 公司，批号 MECD0015 0940），葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）（上海聚生源生物科技有限公司，批号：111027）；氧化型辅酶Ⅱ（NADP＋）（上海聚生源生物科技有限公司，批号：120117）；Wistar大鼠肝微粒体由上海瑞德肝脏疾病研究（上海）有限公司提供，批号：BDVH；甲醇、甲酸为色谱纯，水为超纯水，其余药品和溶剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 钩吻素子溶液的配制 精密称定钩吻素子对照品适量，溶于甲醇溶液中，配成100 mM的母液，4℃冰箱中保存备用，临用前稀释成所需浓度。

2.1.2 内标溶液的配制 精密称定钩吻碱甲适量，溶于甲醇，配成10 μg／mL的内标溶液，存放在4℃冰箱中备用。

2.1.3 空白温孵液 大鼠肝微粒体经过100℃高温灭活，用磷酸盐缓冲液稀释成蛋白浓度为0.5 mg／mL的空白温孵液。

2.2 孵育体系及样品处理 温孵体系包括肝微粒体（1.0 mg／mL）、G-6-P（10 mM）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（1 U／mL）、MgCl2（4 mM）、磷酸盐缓冲液（100 mM）、底物（相应浓度）和 NADP＋（1 mM），总体积为200 μL。反应体系中有机溶剂的浓度均小于0.5%，反应从加入辅助因子NADP＋开始，37℃振荡水浴孵育30 min后，加入冰冷甲醇397 μL和内标液3 μL，冰浴终止反应，20 000×g离心10 min，吸取上清液550 μL，在 60℃氮气流下吹干，用 200 μL 20%甲醇溶液重组复溶，再20 000×g离心10 min，吸取上清液，进行分析。

2.3 色谱方法与质谱条件

2.3.1 液相色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，USA）；柱温为40℃；流速为0.3 mL／min；流动相采用含0.1%甲酸的甲醇溶液（A）－0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（时间 ／A%）：0／20，1／35，4／35，5／60，6／70，7／20；进样体积为 1 μL。

2.3.2 质谱条件 MS采用正离子、多反应监测（MRM）模式监测，离子监控通道m／z 307.1＞69.76（钩吻素子），m／z 323.1＞69.76（钩吻碱甲，内标）；毛细管电压2.8 kV，锥孔电压35 V，离子源温度110℃，脱溶剂温度 300℃，锥孔气（N2）流速 50 L／h，脱溶剂气（N2）流速 450 L／h。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 取空白温孵液和肝微粒体温孵样品（加入 20 μM 钩吻素子），按“2.2”项下操作方法处理后测定，见图1。实验结果表明空白温孵液中无内源性物质干扰目标分析物的检测。

2.4.2 线性关系 精密量取适量钩吻素子对照品母液，再用甲醇稀释成不同浓度的系列标准液，加入空白温孵液，其余的实验步骤按“2.2”项下操作方法处理测定。以浓度为横坐标，峰面积比值为纵坐标作线性回归，计算得回归方程y＝0.1544x＋0.0593（r＝0.9939，n＝5）。结果表明： 钩吻素子在 0.5～30 μM浓度范围内线性关系良好。

2.4.3 准确度与精密度 在空白孵育液中加入不同浓度的钩吻素子溶液，配置成0.5、5和30 μM的低、中、高3种浓度QC样品溶液，各6份，按照“2.2”项操作方法处理后进样测定，连续测定5 d。计算准确度和精密度，结果见表1。

表1 钩吻素子精密度和准确度

2.5 酶促动力学研究

2.5.1 温孵时间的影响 温孵体系中底物钩吻素子的浓度为30 μM，肝微粒体蛋白浓度为1.0 mg／mL，37℃温孵， 分别于 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min取样，处理后进样测定。结果表明：钩吻素子在0～30 min呈线性减少，30～100 min钩吻素子的剩余量不再发生变化，因此反应30 min为最佳温孵时间。

2.5.2 蛋白浓度的影响 孵化体系中钩吻素子的浓度为30 μM，大鼠肝微粒体蛋白浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0 mg／mL，温孵 30 min，处理后测定。结果表明：钩吻素子的剩余量在0.25～1.0 mg／mL呈线性减少，在1.0～2.0 mg／mL钩吻素子的剩余量几乎不再变化，说明酶已接近饱和状态。因此选择1.0 mg／mL为最佳蛋白浓度。

2.5.3 酶促动力学参数的测定 钩吻素子选用浓度为 2、5、10、20 和 30 μM 的体系浓度（S），肝微粒体蛋白浓度 1.0 mg／mL，37℃孵育 30 min，其它步骤同“2.2”项下样品处理方法。以随行标准曲线计算钩吻素子的剩余量，进而求得减少速率（V）。实验数据采用Linewearve-Burk双倒数作图法，以V-1对S-1作图，得到直线，其纵截距为Vmax-1，横截距为Km-1进行计算，代谢清除率为Vmax／Km。钩吻素子的回归方程为 Y＝0.0468X＋0.0033，r＝0.9899（见图 2），计算得钩吻素子的酶促反应动力学参数Km为14.2 μmol／L，Vmax为 303.03 pmol／（min·mg·pro） 以及肝清除率CLint（Vmax／Km）为 21.37 μL ／（min·mg·pro）。

3 讨 论

本实验利用三重四级杆超高效液相-质谱联用仪中其质谱技术的多通道监测功能和超高效液相色谱技术的卓越分离能力，使UPLC-MS／MS技术对检测样品的时间和成本大大下降。该技术有较好选择性和较高灵敏度，有利于实验的定量测定。

图2 钩吻素子1／V随1／S变化曲线

肝脏CYP450酶主要存在于肝微粒体中，是动物体中参与外源性物质代谢的主要酶系，有种属性差异。本实验采用NADP＋还原系统启动酶促反应，过模拟体内环境，研究钩吻素子的酶促反应动力。依据钩吻素子的剩余量随底物浓度及温孵时间的变化，找到了最佳温孵条件。结果表明：Wistar大鼠肝微粒体中的细胞色素P450酶参与了钩吻素子的生物转化。课题组其他成员前期采用SD大鼠肝微粒和HPLC法研究钩吻素子的代谢，并未发现代谢产物，这可能与采用的HPLC法灵敏度不足有关。本实验结果为进一步开展钩吻生物碱的不同种属动物毒性差异与代谢相关性研究奠定了基础。钩吻素子是中草药钩吻中的主要活性与毒性成分之一，通过单一成分在肝微粒体中的代谢研究，为阐明其在体内的代谢机制提供实验数据。

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