痛风宁颗粒对急性痛风性关节炎模型大鼠膝关节 PGE-2、IL-8 及 IκB-α、IKK-α 的影响

苏友新，陈宝军，赵富强，闫 虎，周必洪，张 庆，张子怡

（福建中医药大学，福建 福州 350122）

本课题组前期研究［1-3］发现，痛风宁颗粒具有较好的抗炎、消肿、镇痛等功效，对急、慢性痛风疗效显著；并通过检测急性痛风性关节炎模型大鼠关节滑膜“TLR-ILR／NF-κB”通路中某些信号分子的表达情况， 已确定 IL-1R、MyD88、TLR-2、TLR-4 等与痛风宁颗粒的消肿、镇痛等作用关系密切［4-5］。为进一步阐明痛风宁颗粒对急性痛风性关节炎模型大鼠抗炎、镇痛的作用机制，本实验选取该信号通路下游起关键作用的 IκB-α、IKK-α 及炎性因子 PGE-2、IL-8作为指标进行观察。

1 材料与方法

1.1 实验动物 45只健康SPF级SD大鼠，均为雄性，体重（200±10）g，由上海 Slacsis lab animal有限公司提供［许可证号：SCXK（沪）2011-0015］，委托福建中医药大学实验动物中心代购并饲养。

1.2 试剂及药物 微晶型尿酸钠（美国Sigma公司，批号：108K5309）；大鼠 IL-8、PGE-2 的 ELISA 试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，批号：1103182、1103251）；兔抗大鼠 IκB-α、IKK-α 多克隆抗体（英国 abcam 公司，编号：GR27736-1、GR38675-1）；羊抗兔SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，编号：SA1022）；DAB染色试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号：990799）；痛风宁颗粒：每克含生药3.2 g（福州辰星药业有限公司提供，产品批号：101024）；痛风定胶囊：每粒 0.4 g（成都中汇制药有限公司，产品批号：100701）；塞来昔布胶囊：每粒200 mg（由辉瑞制药有限公司进口分包装，分包装批号：95800309）。

1.3 主要仪器 RM2135切片机（德国LEICA公司）；AHB-LB-1万能研究显微镜（上海实验仪器总厂）；Allegra 64R低温高速离心机（美国 Beckman Coulter公司）；ELX808酶联免疫检测仪（美国BIOTEK）；Image pro plus 6.0专业图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）；超纯水制备系统Milli-Q Advantage（美国密理博）。

1.4 实验方法

1.4.1 药品制备

1.4.1.1 尿酸钠悬浊液的制备 用电子天平称取微晶型尿酸钠2.5 g，高温高压，取无菌生理盐水定容至100 mL，混匀，制成2.5%的尿酸钠悬浊液，保存于4℃冰箱，用前摇匀。

1.4.1.2 干预药物的制备 成人每日痛风宁颗粒用量27 g，痛风定胶囊用量4.8 g，塞来昔布胶囊用量400 mg，按照人与大鼠药量关系［6］换算得出大鼠每日以上 3 个药物用量分别为 2.93、520、43.3 mg／kg。然后根据每只大鼠体重得出其具体用药量，加入2 mL蒸馏水，混匀，制成混悬液。

1.4.2 动物的分组及造模 45只大鼠适应性喂养1周后用随机数字表法分为正常组、模型组、痛风宁组、痛风定组、塞来昔布组共5组，每组9只，称重并编号；参照Coderre造模方法［7］，各组大鼠均以右膝关节为中心常规消毒，正常组大鼠以右膝关节外侧膝眼进针，向关节腔内注射0.2 mL生理盐水，其余4组以同样方法右膝关节每个关节注射0.2 mL配制好的2.5%尿酸钠悬浊液。

1.4.3 用药干预 造模1 h后，痛风宁组、痛风定组、塞来昔布组大鼠按照体重分别予以相应药物混悬液2 mL灌胃，正常对照组、模型对照组大鼠以2 mL生理盐水灌胃，每天1次，连续灌胃3 d。

1.4.4 标本采集 末次灌胃1 h后，采用300 mg／kg剂量水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，以右膝关节为中心，常规备皮，碘伏消毒，戴无菌手套，然后切开右膝关节囊，用1 mL生理盐水冲洗关节腔，收集冲洗液；切取关节囊，采用4%中性甲醛固定液处理固定。

1.4.5 关节液细胞因子PGE-2、IL-8含量的检测采用酶联免疫试剂盒检测关节冲洗液中PGE－2、IL-8的含量。具体步骤按试剂盒说明操作。

1.4.6 关节滑膜组织中IκB-α、IKK-α表达的检测采用免疫组化技术测定关节滑膜组织中IκB-α、IKK-α的含量。一抗稀释200倍，设PBS替代一抗的空白阴性对照；采用Image Pro Plus 6系统分析免疫组化图像：免疫组化阳性反应为细胞胞浆内呈棕黄色或深棕黄色，阴性反应为胞浆内未着色。每张切片随机分析5个不重叠视野（×400），100细胞以上，检测这5个随机视野内的阳性染色面积及积分光密度值，以5个视野所得的数据的平均值作为最后结果。

2 结 果

2.1 关节液中细胞因子PGE-2和IL-8含量的变化见表1。

表1 5组PGE-2和IL-8含量的比较（）pg／mL

表1 5组PGE-2和IL-8含量的比较（）pg／mL

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05；与痛风宁组比较，3）P＜0.05；与痛风定组比较，4）P＜0.05。

IL-8 14.01±3.40 52.81±4.311）20.96±3.081）2）30.02±4.061）2）3）21.61±3.311）2）4）组 别正常组模型组痛风宁组痛风定组塞来昔布组n99999 PGE-2 45.87±16.41 109.56±24.471）3）41.40±9.442）110.91±33.071）3）92.52±14.741）3）4）

正常组、痛风宁组关节液中细胞因子PGE-2含量显著低于其它3组（P＜0.05）；模型组与痛风定组、塞来昔布组比较无显著性差异。正常组关节液中IL-8显著低于其它各组（P＜0.05），而模型组显著高于其它各组（P＜0.05）；治疗的3组比较，痛风宁组低于痛风定组（P＜0.05），痛风宁组与塞来昔布组之间无显著差异；痛风宁组仍高于正常组（P＜0.05）。

2.2 关节滑膜组织中IKK-α及IκB-α表达的变化见表2。

表2 5组关节滑膜组织中IKK-α及IκB-α的平均光密度值比较（）IOD／单位面积

表2 5组关节滑膜组织中IKK-α及IκB-α的平均光密度值比较（）IOD／单位面积

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05；与痛风宁组比较，3）P＜0.05；与痛风定组比较，4）P＜0.05。

IκB-α 光密度值0.3731±0.0282 0.2563±0.01921）0.3150±0.01561）2）0.2870±0.02551）2）3）0.3125±0.02231）2）4）组 别正常组模型组痛风宁组痛风定组塞来昔布组n99999 IKK-α光密度值0.3360±0.0155 0.4051±0.01391）0.3541±0.01701）2）0.3817±0.01941）2）3）0.3538±0.01201）2）3）4）

正常组关节滑膜组织IKK-α平均光密度值显著低于其它4组（P＜0.05），而模型组较其它组高（P＜0.05）；痛风宁组和塞来昔布组较模型组及痛风定组低（P＜0.05）。正常组关节滑膜组织中IκB-α平均光密度值显著高于其它4组（P＜0.05），而模型组较其它组低（P＜0.05）；治疗的3组比较，痛风宁组显著高于痛风定组（P＜0.05），与塞来昔布组比较无显著性差异。

3 讨 论

在急性痛风性关节炎发生阶段，由于尿酸盐结晶的刺激，病变局部出现微小血管充血，促使血管内皮细胞损伤，进而引起血管内壁通透性增加，炎性渗出增多，导致组织水肿，引发局部疼痛，伴随着产生大量炎性因子如 PGE-2、IL-8 等［8-9］。PGE-2 的作用引起剧烈疼痛，IL-8可进一步趋化中性粒细胞、淋巴细胞等到炎症局部，加剧炎症反应［8］，形成恶性循环，最终加重痛风性关节炎的急性发作。因此，病变关节液中PGE-2、IL-8等含量的变化可以在一定程度上反映急性痛风性关节炎的炎症程度。

目前研究发现，在急性痛风性关节炎发病过程中伴随着诸多信号通路的激活或抑制，“TLR-ILR／NF-κB”信号通路系统就是其中重要的一个。“TLRILR／NF-κB” 信号通路的激活对 PGE-2、IL-8 等炎性因子的调控起着至关重要的作用［10］。研究表明：尿酸钠结晶（MSU）在痛风性关节炎急性发作时，可同时激活IL-1受体（IL-1R）和Toll受体（Toll-like receptors，TLRs）［11-12］，活化的 IL-1R 和 TLRs 通过与胞浆内衔接蛋白MyD88结合而形成复合物，前者可募集结合IRAK（IL-1受体相关激酶）并使之活化；活化的IRAK与TRAF6（TNF受体相关因子）结合后，又活化 TAK1（TGF-β 活化的激酶）， 导致 IκB（inhibitor of κB）激酶级联反应，使转录因子 NF-κB 等激活。NF-κB 位于“TLR-ILR／NF-κB”信号通路下游的枢纽位置，作为一个重要的核转录因子，其作用范围广，对该信号通路激活后的效应调控有重要意义。活化的NF-κB进入细胞核，可有效调节细胞因子如PGE-2、IL-8及急性反应期蛋白诱导的效应因子酶iNOS等基因的表达［10］。NF-κB激活过程的环节多，IKK-α和IκB-α是NF-κB活化过程中的2个关键影响因子。IKK-α可促使胞浆中与NF-κB结合成非活化状态三聚体复合物的IκB-αSer32／36磷酸化及泛素化，使得后者易被26S蛋白酶小体降解从而暴露 NF-κB，引起 NF-κB 的激活［13］；而 IκB-α 可以抑制“TLR-ILR／NF-κB”信号通路 NF-κB 的活化。有研究证明：小鼠缺失IκB-α后出现各种免疫性疾病与 NF-κB 被过量激活相关［14］。故 IKK-α、IκB-α 的表达高低在一定程度上可以反映 “TLR-ILR／NF-κB”信号通路下游的活动状态，对NF-κB的活化及PGE-2、IL-8的调控发挥了重要作用。

本实验观察到痛风宁颗粒能够降低大鼠病变关节关节液中PGE-2、IL-8的含量，降低病变关节滑膜组织IKK-α的表达，促进IκB-α表达，与模型组及痛风定组比较均有显著差异（P＜0.05）。提示痛风宁颗粒对急性痛风性关节炎的抗炎、镇痛作用可能与降低“TLR-ILR／NF-κB”信号通路下游关键信号分子IKK-α的表达，减少IκB-α的降解，进而抑制IL-8、PGE-2的表达有关。

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