猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

姜 雪,高玉伟,胡桂学,杨松涛,赵艳丽,刘秋燕,徐春忠,梁秀娟,夏咸柱

(1.吉林农业大学 动物科学技术学院,长春 130118;2.解放军军事医学科学院 军事兽医研究所,长春 130062;3.上海野生动物园,上海 201300；4.吉林省野生动物救护繁育中心,长春 130122)

猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)为单股正链RNA,无囊膜,直径30～40 nm[1],是一种猫和部分猫科动物普遍存在的病原体.易感动物感染FCV后表现为口腔溃疡、上呼吸道感染、慢性口炎、鼻炎、结膜炎、肺炎或跛行等临床症状[2-3]，其临床症状的多样性取决于FCV基因的多样性[4],与由猫疱疹病毒(FHV)引起的猫传染性鼻炎相似,二者也常混合感染[5].高致病性FCV可引起动物全身性感染,甚至死亡.感染FCV的猫一部分恢复健康,另一部分成为无症状的病原携带者[6].检测FCV的方法有病毒分离鉴定和血清学实验,对分离的病毒可通过电镜检查、RT-PCR、荧光定量PCR鉴定或与已知抗血清做中和、琼扩、免疫荧光或补结实验进行鉴定[1].其中荧光定量PCR方法应用广泛[7-12],如Sykes等[13-14]建立了对FCV检测的普通PCR方法;Helps等[15]用染料法建立了FCV荧光定量PCR检测方法;Wilhelm等[16]以FCV的ORF2为目的基因建立了荧光定量PCR方法检测FCV,最低检测范围为(5×101～5×102)拷贝/μL.本文通过优化FCV荧光定量PCR条件,为临床样品的检测提供准确而快速的检测方法.

1 材料与方法

1.1 毒株和细胞

FCV由军事兽医研究所于2012年分离自国内某患病死亡的虎；猫鼻气管炎病毒(FRtV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV)和猫肾细胞(F81)均为吉林农业大学动物科学技术学院实验室保存.

1.2 主要仪器和试剂

德国Tiangen公司生产的Agilent Mx3000P型实时荧光定量PCR仪;美国ABI公司生产的PCR仪;德国Bio-Lmaging Systems公司生产的凝胶成像系统;美国Qnawell公司生产的核酸蛋白分析仪.

质粒小提试剂盒(D100)和琼脂糖凝胶回收DNA试剂盒(D100)购自北京索莱宝科技有限公司;反转录试剂盒(AT301)和pEASY-Blunt载体(CB101-01)购自全式金生物技术有限公司;TRIZOL试剂(D9108A)、Pfu酶(D7336)、大肠杆菌感受态DH5α(D9057)、DL 2000 DNA Marker(D501S)和荧光定量PCR试剂盒(DRR390)等均购自大连宝生物工程有限公司.

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中编码FCV衣壳蛋白ORF2的保守区基因序列,利用Primer5.0软件,设计并合成一对特异性引物及探针.上游引物：5′-CTGACTTCAAATTTCATCTC-3′;下游引物：5′-TGGGAATTAAGTCAGAGG-3′;探针：5′-(FAM)ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC(Eclipse)-3′.探针以FAM为报告基团,以Eclipse为淬灭基团.引物及探针均由大连宝生物工程有限公司合成.

1.4 标准阳性模板的制备

用FCV病毒接种F81细胞,待细胞出现80%病变(CPE)后,反复冻融3次,收获细胞毒.用TRIZOL法提取细胞毒RNA,提取产物直接进行反转录获得病毒cDNA作为扩增模板.反转录体系：总RNA模板5 μL,随机引物1 μL,2×TS反转录预混液10 μL,反转录酶RT 1 μL,去RNA酶水(DEPC)处理水补到20 μL.反应条件：25 ℃孵育10 min,42 ℃孵育30 min,85 ℃加热5 min.PCR扩增体系：cDNA模板3 μL,5倍Pfu缓冲液10 μL,dNTP 3 μL,上游引物F 1 μL,下游引物R 1 μL,Pfu酶0.5 μL,DEPC处理水补到29.5 μL.PCR反应参数：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s,59.3 ℃ 20 s,72 ℃ 75 s,30个循环；72 ℃ 5 min,4 ℃保温.以质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后,利用凝胶回收试剂盒获得FCV病毒ORF2基因PCR扩增产物,将回收的产物连接pEASY-Blunt载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆菌摇菌,提取质粒,经PCR和测序鉴定.测定其OD值,并根据公式计算重组质粒的DNA质量浓度与纯度.将重组质粒进行10倍梯度稀释,保存备用.

分子拷贝数(个/mL)=DNA质量浓度/DNA分子量,DNA分子量=DNA碱基数×660,DNA质量浓度=A260g/μL×稀释倍数×6.02×1023.

1.5 实时荧光定量PCR检测方法的建立

反应体系：DNA模板2 μL,EXTaq酶预混液12.5 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,探针1.0 μL,DEPC处理水补到25 μL.在Agilent Mx3000P型实时荧光定量PCR仪上反应,反应条件：95 ℃ 30 s,94 ℃ 5 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,45个循环；退火期收集荧光信号.用矩阵法在引物浓度为0.16,0.20 μmol/L,探针浓度为0.32,0.40,0.48,0.56 μmol/L的反应体系筛选引物和探针的最佳使用量,以获得最低Ct值、典型荧光扩增曲线、较高荧光强度的引物和探针最佳浓度.

1.6 标准曲线的建立

实验采用已优化的荧光定量PCR反应条件,分别以梯度浓度稀释的含目的基因质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,并利用Agilent Mx3000P型实时荧光定量PCR仪软件进行分析,选取最佳浓度建立标准曲线.

1.7 特异性实验及灵敏度与重复性实验

用所建立的荧光定量PCR方法检测FCV,FRtV,FPV,用双蒸馏水作为阴性对照,以检测其特异性.

将已计算出拷贝数的含目的基因质粒做10倍梯度稀释,稀释至用荧光定量PCR仪不能检出的稀释倍数,计算荧光定量PCR所能检测的最低模板拷贝数.对同一阳性样品进行4次重复检测,通过组内重复的荧光扩增曲线变化及Ct值变化评估该方法的重复性.

1.8 疑似临床样本的检测

用所建立的荧光PCR方法,对从长春市某宠物医院收集的24份疑似FCV患病猫的咽试子样本进行检测.

1.9 病毒的分离与鉴定

将荧光定量PCR方法检测结果为阳性的咽试子加适量DMEM稀释后,于12 000 r/min离心10 min,取上清液加每毫升1 600单位的双抗处理后接种单层F81细胞,盲传5代观察细胞是否产生特征性病变.对产生特异性病变的细胞反复冻融3次收取病毒液,进行RT-PCR鉴定.根据GenBank中已发布的FCV病毒ORF3基因序列设计一对特异性引物,预期扩增片段为550 bp,由北京博士生物公司合成.上游引物5′-TCCTTYGCAGTYTATAGAATAATTG-3,下游引物5′-TTATATCCCTGGGGTTAGGC-3′,Y: C/T.用TRIZOL法提取细胞毒的RNA,提取产物直接进行反转录获得病毒cDNA作为扩增模板.反转录过程按说明书操作.PCR扩增体系：DNA模板2 μL,10×Taq缓冲液2.5 μL,dNTP 2 μL,上游引物F 0.5 μL,下游引物R 0.5 μL,ExTaq酶0.3 μL,DEPC处理水补到25 μL.PCR反应参数：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30 个循环；72 ℃ 10 min,4 ℃保温.反应结束后,取3 μL PCR产物进行质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定.

2 结 果

2.1 荧光PCR反应条件优化

图1 引物和探针浓度的优化Fig.1 Optimization of the concentrations of primer and probe

采用矩阵法选取引物和探针的最佳浓度,结果如图1所示.在c(引物)=0.20 μmol/L和c(探针)=0.40 μmol/L的条件下,对含目的基因质粒的检测可获得较合适的Ct值和较大的ΔRn.优化的荧光定量PCR反应条件为: 95 ℃ 30 s,95℃ 5 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,循环数为45,退火阶段收集荧光信号.

2.2 标准曲线的建立

按已优化反应条件,对103,104,105,106,107和108六个梯度含目的基因的质粒进行荧光定量PCR实验,结果如图2所示.由图2可见,反应结束后所产生的标准曲线呈较好的线性关系.相应的拷贝数X与Ct值的线性关系为Ct=-3.288xlgX+46.72.

2.3 特异性实验

用建立好的方法对FCV,FRtV,FPV的核酸及双蒸馏水进行荧光定量PCR检测,结果如图3所示.由图3可见,仅FCV产生荧光信号,呈现良好的特异性.

图2 实时荧光定量PCR方法的标准曲线Fig.2 Standard curve of real time PCR

图3 特异性实验结果Fig.3 Test of specificity

2.4 敏感性实验结果

将计算出拷贝数的质粒做10倍系列稀释,进行荧光定量PCR实验,结果如图4所示.由图4可见,荧光定量PCR检测到的最低浓度为2.26×101拷贝/μL,表明该方法具有较高的灵敏度.

2.5 重复性实验结果

对阳性样品进行4次重复检测,结果如图5所示.通过统计分析可得变异系数为2.158%,表明该方法具有较好的准确性和重现性.

图4 敏感性实验结果Fig.4 Test of sensibility

图5 重复性实验结果Fig.5 Curves of repeat test

2.6 疑似临床样品的检测及病毒分离鉴定结果

M：DL 2000分子量标准;1,2,3：PCR产物；4：阴性对照.图6 RT-PCR结果Fig.6 Result of RT-PCR

用优化后的荧光定量PCR方法对24份疑似患FCV病猫的唾液样品进行检测,结果为阳性样本3份,阴性样本21份,FCV的检出率为12.5%.采用F81细胞从荧光定量PCR阳性样本中分离病毒,3 d后,细胞均出现圆缩、葡萄串样和细胞脱落等病变.采用普通RT-PCR鉴定细胞培养物,结果均获得预期核苷酸片段,如图6所示.因此,本文建立的荧光定量PCR方法可较敏感地检测出阳性样本.

综上可见,本文建立的FCV荧光定量PCR方法,检测标准品的线性关系为0.992,最低检测为2.26×101拷贝/μL,具有较高的敏感性；特异性实验结果表明,该方法仅能检测FCV,无法检测其他相关病毒,呈现出良好的特异性；重复性实验表明,批内变异系数为2.158%,重复性较好；临床疑似样品的检测率为12.5%,与文献[17]结果相符.

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