比阿培南开环物杂质的确证及含量测定Δ

陈松杰，王德刚，张 莉，钟雅妮（珠海联邦制药股份有限公司，广东中山 528467）

比阿培南（Biapenem）是一种新型1β-甲基碳青霉烯类抗生素，具有抗菌谱广、对肾脱氢肽酶稳定、药动学参数优良、临床治疗效果好、耐受性好和不良反应少等特点[1]。目前各国药典均未收载比阿培南。经分析其主要降解产物为聚合物和开环物，文献[2-6]中多对其聚合物进行研究，对其开环物的研究鲜有报道。而从比阿培南聚合物的产生途径可知，其开环物可与比阿培南反应生成二聚物，故对开环物进行控制可在一定程度上降低聚合物产生的可能性。

笔者另查阅注射用Omegacin的说明书[7]知，原研品中可能存在的杂质包括2个开环物，现暂命名为比阿培南开环物A和开环物B，且开环物A为比阿培南体内代谢产物。本文通过试验建立了测定比阿培南开环物杂质的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，并采用色谱-质谱（LC-MS）方法对其结构进行确证，同时考察了自制样品及原研品中开环物杂质的含量水平。

1 材料

LC-20AT型HPLC仪、SPD-M20A二极管阵列检测器（日本Shimadzu公司）；AE240型电子天平（瑞士Mettler toledo公司）；6120型单四级杆液质联用仪（美国Agilent公司）。

比阿培南原料药（自制，批号：4031204001、4031204002、4031204003，纯度：99.96%、99.96%、99.95%）；注射用比阿培南（原研品，日本明治制果制药株式会社，批号：4004，测定时已近效期，规格：每支0.3 g）；比阿培南开环物B杂质对照品（自制，经质谱、元素分析及核磁共振氢谱确证其结构，批号：120703，纯度：99.8%）；由于比阿培南开环物A杂质对照品获得较为困难，因此拟取其HPLC洗脱成分采用LC-MS方法确证其结构；乙腈为色谱纯，水为自制超纯水，其他各试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

HPLC色谱条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.01 mol/L四丁基溴化铵溶液-乙腈-三乙胺（980∶20∶2，用磷酸调节pH值至6.0），流速为1.0 ml/min，检测波长为254 nm，柱温为30℃。

LC-MS色谱条件：色谱柱为GL Sciences C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.01 mol/L醋酸铵溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，柱温为30℃。按表1进行线性梯度洗脱。

表1 线性梯度洗脱表Tab 1 Linear gradient elution

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；正离子模式采集数据；选择一定质荷比（m/z）范围内的全扫描，m/z为100～800；氮气流速为10 L/min，雾化器压力为35 psig，干燥气体温度为300℃，毛细管电压为4.0 kV。

2.2 溶液的制备

2.2.1 系统适用性试验溶液制备。取比阿培南原料药（批号：4031204001）约15 mg，置于10 ml量瓶中，加适量流动相溶解后，于80℃水浴破坏15 min，放冷至室温，加5%甲酸溶液0.5 ml，再加流动相稀释至刻度，摇匀，即得含有比阿培南2个开环物杂质的溶液，作为系统适用性试验溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备。取供试样品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 ml中含1.5 mg的溶液，作为供试品溶液（临用新制）。

2.2.3 对照溶液的制备。精密量取供试品溶液适量，加流动相定量稀释制成15 μg/ml的溶液，即得。

2.2.4 比阿培南开环物A定位溶液的制备。取系统适用性试验溶液继续水浴破坏，同时增加进样体积，在检测器出口处收集第1个峰面积显著增大的杂质的洗脱成分，即得。

2.2.5 比阿培南开环物B对照品溶液的制备。取比阿培南开环物B杂质对照品适量，加流动相溶解，摇匀，即得。

2.3 系统适用性试验溶液破坏条件的确定

比阿培南结构中的内酰胺环不稳定，在高温、酸或碱条件下易开环，降解为比阿培南开环物A；且开环后产生的—COOH基不稳定易脱去生成甲酸，甲酸使比阿培南开环，并与五元环上的—NH结合产生开环物B。因此选择一定量的甲酸为破坏溶剂进行试验。取系统适用性试验溶液20 μl注入色谱仪，记录色谱图，主峰后峰面积显著增大的2个杂质峰依次为比阿培南开环物A、B。主峰与比阿培南开环物A色谱峰的分离度应大于1.5。

比阿培南可能降解的途径如图1所示：

图1 比阿培南开环物可能的降解途径Fig 1 Potential degradation pathway of biapenem openring impurities

2.4 比阿培南开环物的结构确证

取系统适用性试验溶液，进行LC-MS联用分析，结果检出2个较大的降解杂质峰，保留时间约为3.8 min的杂质准分子离子峰的m/z分别为369、325，与[M+H]+、[M-COOH+H]+对应，即m/z为369的峰分子质量为368，与比阿培南开环物A的分子质量368一致；m/z为325的峰为比阿培南开环物A的碎片离子，因比阿培南开环后—COOH基易脱去，形成该碎片离子；保留时间约为5.4 min处的杂质准分子离子峰[M+H]+的m/z为397，即m/z为397的峰分子质量为396，与比阿培南开环物B分子质量396一致，且其保留时间及m/z均与比阿培南开环物B对照品一致。表明系统适用性试验溶液中降解产生的2个较大杂质分别为比阿培南开环物A、B，详见图2。

图2 降解杂质经LC-MS结构确证分析结果A.总离子流图；B.开环物B的MS图；C.开环物A的MS图；1.比阿培南；2.开环物A；3.开环物BFig 2 LC-MS analysis results of structural identification of impurity by degradationA.TIC；B.MS chromatograms of open-ring impurity B；C.MS chromatograms of open-ring impurity A；1.biapenem；2.open-ring impurity A；3.open-ring impurity B

2.5 比阿培南开环物在2种色谱系统中的相互识别

通过对比2种色谱系统中杂质含量，结果系统适用性试验溶液在HPLC色谱系统中的2个峰面积显著增大的杂质，分别与LC-MS系统下峰面积显著增大的杂质含量基本吻合，两者存在对应关系；另采用开环物B杂质对照品在HPLC色谱系统进行定位，可证明第2个显著增大的杂质即为比阿培南开环物B；收集HPLC色谱系统系统适用性试验溶液中第1个显著增大杂质的洗脱成分，再在LC-MS系统中进样测试，其保留时间与比阿培南开环物A一致，且其分子质量为368，与比阿培南开环物A分子质量亦一致，可证明第1个显著增大的杂质即为比阿培南开环物A。

由此说明，LC-MS系统检出分子质量为368和396的杂质，分别与HPLC色谱系统检出的2个杂质为同一物质，即HPLC色谱系统中此2个杂质分别为比阿培南开环物A、B。

2.6 比阿培南开环物A、B的含量测定

2.6.1 系统耐用性试验及开环物峰位的确定。照“2.1”项下HPLC色谱条件，取系统适用性试验溶液，分别采用Thermo Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和大连依利特ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3种不同厂家色谱柱，在不同仪器上进行试验。结果系统适用性试验溶液中开环物A与比阿培南的分离度均大于1.5，开环物B保留时间与开环物B对照品一致；且比阿培南开环物A和B均增加明显，便于对杂质进行定位，方法可行，耐用性好。因此采用系统适用性试验溶液对开环物进行定位。

2.6.2 专属性试验及开环物降解途径考察。取比阿培南原料药（批号：4031204001）适量，分别经水浴和5%甲酸溶液（系统适用性试验溶液）、高温（80℃）、光照[（4500±500）lx]、高湿（相对湿度92.5%）及原料药溶液经85℃水浴破坏后制成的溶液进样分析；同时取比阿培南开环物B对照品适量，加流动相制成一定质量浓度的溶液进样分析，记录色谱图，考察方法专属性。空白（流动相）、开环物B对照品及样品经高温、高湿、光照、水浴及强酸破坏后的色谱见图3。

图3 方法专属性考察HPLC图谱A.空白（流动相）；B.样品；C.系统适用性试验溶液；D.高温破坏后样品；E.光照破坏后样品；F.高湿破坏后样品；G.水浴破坏后样品；H.开环物B对照品；1.比阿培南；2.开环物A；3.开环物BFig 3 HPLC chromatograms of method specificityA.blank（mobile phase）；B.sample；C.solution of system suitability test；D.sample destroyed by high temperature；E.sample destroyed by light；F.sample destroyed by humidity；G.sample destroyed by water bath；H.open-ring impurity B control；1.biapenem；2.open-ring impurityA；3.open-ring impurity B

结果表明，样品水溶液在水浴破坏条件下，开环物A增加显著，但未降解产生开环物B；经水浴及强酸破坏（即系统适用性试验溶液）后，开环物A及开环物B均增加显著；高温、高湿及光照条件下开环物A、B均未显著增加，表明在此几种条件下开环物不易产生。降解产生的开环物B杂质与其对照品保留时间一致；空白溶剂不影响比阿培南及其开环物的检出；各降解杂质均能与开环物分离完全。本色谱系统专属性良好。因系统适用性试验即是在酸性环境下使比阿培南水解，试验结果表明水解产物对测定无干扰，故专属性试验不再考察酸碱水解对测定的干扰。

2.6.3 线性关系试验。精密称取比阿培南原料药（批号：4031204001）和比阿培南开环物B对照品适量，加流动相溶解后，再加流动相定量稀释制成系列质量浓度分别为0.077、0.155、0.309、0.464、0.773、1.237、1.546 mg/ml和 0.765、1.53、3.06、4.59、7.65、12.24、15.30、22.95 μg/ml的混合溶液，摇匀，即为线性试验溶液。进样测试，将测得的峰面积（y）与质量浓度（x）作线性回归。结果比阿培南的线性方程为：y＝758510x－1021662（r＝0.9955）；比阿培南开环物B的线性方程为：y＝1172380x－2703（r＝0.9999）。表明比阿培南与比阿培南开环物B检测质量浓度线性范围分别为0.077～1.546 mg/ml、0.765～22.95 μg/ml。

2.6.4 定量限及检测限试验。取“2.6.3”项下线性试验溶液，逐步稀释制成一定质量浓度的溶液，进样测试。得比阿培南与比阿培南开环物B的定量限（信噪比约为10∶1）分别为2.1、2.3 ng，检测限（信噪比约为3∶1）分别为0.6、0.9 ng。

2.6.5 比阿培南开环物B回收率试验。精密称取比阿培南开环物B适量，加流动相溶解并制成0.15 mg/ml的溶液，作为杂质贮备液。再精密称取本品9份，各约30 mg，分别置于9个20 ml量瓶中，分3组，各3份，每组分别加入精密量取的杂质贮备液（0.15 mg/ml）1.6、2.0、2.4 ml，再加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为比阿培南开环物B回收率试验的供试品溶液（按比阿培南开环物B的限度为1.0%进行加样回收试验）；另取杂质贮备液适量，加流动相制成0.015 mg/ml的溶液，作为比阿培南开环物B对照品溶液。精密量取上述供试品溶液及对照品溶液各20µl，分别注入色谱仪，记录色谱图。结果，比阿培南开环物B的平均回收率为100.5%，RSD＝0.7%（n＝3），样品对此杂质的测定无干扰，本方法准确性良好。

2.6.6 样品测定结果。取自制的3批比阿培南原料药及原研品1批，照“2.1”项下色谱条件，取对照溶液20 μl，注入色谱仪，调节检测灵敏度，使主峰的峰高约为满量程的20%；再精密量取供试品溶液和对照溶液各20 μl，分别注入色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的5倍。开环物A、B含量均采用自身对照法计算，结果见表2。

表2 4批样品开环物杂质的含量测定结果Tab 2 Content determination of open-ring impurities in 4 batches of samples

3 讨论

Nan Wang等[8]建立了比阿培南及杂质质控的HPLC分析方法，该方法利用HPLC-二极管阵列检测器（DAD）数据，采用二维色谱光谱相关分析技术及软件，在无杂质对照品的情况下，实现了质控分析HPLC-紫外（UV）色谱中的色谱峰与LCMS色谱图中的色谱峰的相互识别。结果表明比阿培南水解产生的杂质主要为开环物及二聚物，暂命名为比阿培南开环物A及C、比阿培南二聚物A及B。

本文则采用系统适用性试验溶液，在HPLC系统下即可对比阿培南开环物A及B进行定位，不依赖于LC-MS，更适用于日常检验。本文方法与文献[8]方法的条件比较见表3。

综上，本文建立的方法可对比阿培南的2个开环物杂质进行有效分离，方法专属强、灵敏度高，可满足杂质测定要求，因此本法可作为比阿培南中开环物的质控方法。同时，通过系统适用性试验，对特定杂质开环物A和B进行定位，不需要提供杂质对照品，操作方法简便，并可有效保证产品质量安全。

表3 2种分析方法的比较Tab 3 Comparison of 2 kinds of analysis methods

[1]赵敏，赵国君，张勇.新碳青霉烯类抗生素比阿培南[J].中国临床药理学杂志，2005，21（5）：390.

[2]张菁，邢亮彬.HPLC法测定注射用比阿培南的含量及有关物质[J].中国抗生素杂志，2006，31（9）：565.

[3]傅小雅.反相高效液相色谱法测定注射用比阿培南的含量及有关物质[J].海南医学院学报，2005，11（5）：388.

[4]马杰，赵玉新，王广慧，等.凝胶色谱法测定比阿培南聚合物的含量[J].中国当代医药，2010，17（8）：116.

[5]王蓓，张菁，马卫红.注射用比阿培南的有关物质测定方法研究[J].现代中西医结合杂志，2010，19（10）：1247.

[6]刘俊华，张莉，程玉宝，等.HPLC法测定比阿培南二聚物方法研究及其降解途径考察[J].药物分析杂志，2012，32（3）：468.

[7]明治制果制药株式会社.注射用Omegacin 0.3g[EB/OL].（2013-02）[2013-04-15].http：//www.info.pmda.go.jp/.

[8]Nan Wang，Chun-Feng Li，Dou-Sheng Zhang，et al.Establishment of an HPLC method for the analysis of biapenem an its impurities[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2011，20（2）：171.