离子对RP-HPLC法测定利塞膦酸钠原料药及其制剂的含量Δ

张立峰，刘灿仿（邢台医学高等专科学校药剂教研室，河北邢台 054000）

利塞膦酸钠原料药质量检测标准采用国家食品药品监督管理局标准[1]，该标准中含量采用电位滴定法测定，操作烦琐，不适合常规检测。同时，虽有文献[2-9]报道采用高效液相色谱（HPLC）法检测双膦酸盐类药物的含量，但由于该药中含有较多离子基团，故采用文献报道的方法很难在固定相上保留这些基团，从而影响测定结果的准确性。笔者经过多次试验，建立了采用离子对反相（RP）-HPLC法测定利塞膦酸钠原料药及其注射剂含量的方法以及对其合成过程中残余的原料2-（3-吡啶）乙酸和其他氧化分解产物的分离分析方法，从而为该药的质量控制提供了一种可靠的分析手段。

1 材料

液相色谱仪系统包括SP8810型输液泵、SP8450型紫外-可见检测器（美国光谱-物理公司）；HW-2000色谱工作站（南京千谱软件有限公司）；Rheodyne 7725i型六通进样阀（美国Rheodyne公司）。

利塞膦酸钠对照品（批号：20110716，采用电位滴定法测定纯度：99.67%）、2-（3-吡啶）乙酸对照品（批号：20110324，采用HPLC法测定纯度：99.49%）均由河北医科大学药学院提供；利塞膦酸钠原料药（批号：20110314、20110325、20110406，纯度：均＞99%）、注射用利塞膦酸钠（批号：20110811、20110813、20110815，规格：每支5 mg）、利塞膦酸钠注射液（批号：20120107、20120110、20120117，规格：5 mg∶2 ml）均由河北医科大学制药厂提供；四丁基溴化铵、磷酸二氢钠均为分析纯；试验用水均使用二次重蒸水；甲醇为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-5 mmol/L磷酸二氢钠缓冲液（含6 mmol/L离子对试剂四丁基溴化铵溶液，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0）（20∶80，V/V），流速：1.0 ml/min；检测波长：240 nm；进样量：20 μl；柱温：30℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备。称取利塞膦酸钠对照品约25 mg，精密称定，置于25 ml量瓶中，加水溶解、稀释、定容至刻度，摇匀，即得质量浓度约为1.0 mg/ml的对照品贮备液，再用流动相稀释即得质量浓度分别约为8.00、10.00、12.00 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备。称取利塞膦酸钠原料药或注射用利塞膦酸钠约25 mg，精密称定，置于25 ml量瓶中，加入流动相稀释得质量浓度约为1.0 mg/ml的供试品贮备液，再用流动相稀释得质量浓度约为10.00 μg/ml的供试品溶液。

精密量取利塞膦酸钠注射液约10 ml，置于25 ml量瓶中，加入流动相稀释得质量浓度约为1.0 mg/ml的供试品贮备液，再用流动相稀释得质量浓度约为10.00 μg/ml的供试品溶液。

我们把高层建筑可以看作是固定在地面上的一个悬臂结构，它一方面受垂直荷载作用，另一方面受水平荷载作用。其中，垂直荷载使结构产生轴力，其大小与建筑物高度基本呈线性关系；水平荷载使结构产生弯矩，其大小与建筑物高度基本呈二次方变化。一般情况下，对地震作用效应影响较大的是水平荷载，高层建筑抗震结构设计首先要保证建筑物的结构要有较大刚度。高层建筑结构设计的主要矛盾就是抗水平力，我们应根据抗震等级和水平荷载的分布设计采用不同的结构体系。

称取2-（3-吡啶）乙酸对照品25 mg，精密称定，置于25 ml量瓶中，加入流动相稀释得浓度约为1.0 mg/ml的溶液备用。

2.3 线性关系考察

精密量取利塞膦酸钠对照品贮备液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，进样测定，以峰面积（A）对质量浓度（c）作图，进行线性回归，得回归方程为：A＝7.22×103+2.82×103c（r＝0.9998）。表明利塞膦酸钠检测质量浓度线性范围为79.96～799.6 μg/ml。

2.4 稳定性考察

取注射用利塞膦酸钠供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12、24 h时进样测定，记录峰面积。结果RSD＝0.4%（n＝7），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.5 精密度试验

取对照品溶液，连续进样5次测定。结果峰面积值RSD＝0.3%（n＝5），表明本方法精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取同批注射用利塞膦酸钠样品5份，制备供试品溶液，进样。结果平均含量RSD＝0.5%（n＝5），表明本方法重复性良好。

2.7 回收率试验

取注射用利塞膦酸钠同批样品，按测试浓度的80%、100%、120%3个梯度分别加入对照品，每个质量浓度取3份样品，同法操作，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n＝3）Tab 1Results of recovery tests（n＝3）

2.8 样品含量测定

准确称取注射用利塞膦酸钠及对照品适量，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液、对照品溶液，进样，记录峰面积，按外标法以峰面积计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2Content determination of samples（n＝3）

2.9 色谱条件的筛选

2.9.1 色谱柱的选择。分别以Hypersil C8和Hypersil C18柱作固定相，考察磷酸二氢钠缓冲液浓度（5 mmol/L）、流动相pH值（7.0）及甲醇的体积分数（20%）一定时，增加流动相中离子对试剂（同时有减尾剂的作用）四丁基溴化铵溶液浓度（0～8 mmol/L）对利塞膦酸钠峰形的改善情况。结果显示，以Hypersil C18作固定相，利塞膦酸钠的峰形较差且难以改善；而以Hypersil C8作固定相，增加离子对试剂浓度，峰形得到明显改善，能够满足要求。因此最终以Hypersil C8柱作为固定相。

2.9.2 影响色谱行为的因素考察。流动相的pH值、离子对试剂浓度、有机改性剂的体积分数及缓冲液浓度对利塞膦酸钠及其有关化合物[主要指2-（3-吡啶）乙酸]的保留行为有较大的影响。为了获得最佳的分离效果，笔者考察了这些因素对其色谱行为的影响。

（1）pH值的影响。利塞膦酸为四元有机酸，其水溶液显酸性（体积分数为0.7%的利塞膦酸水溶液的pH值约为2.0）；相对于酸性较强的利塞膦酸而言，其合成原料药中的残留物2-（3-吡啶）乙酸是一种非常弱的酸，因此要同时使利塞膦酸钠和2-（3-吡啶）乙酸在离子对色谱中保留，并使利塞膦酸钠与其有关化合物得到良好的分离，关键是选择合适的pH值。当四丁基溴化铵浓度（6 mmol/L）、磷酸二氢钠缓冲液浓度（5 mmol/L）及甲醇的体积分数（20%）一定时，流动相pH值在4.0～7.5时对利塞膦酸钠和2-（3-吡啶）乙酸保留行为的影响见图1A。

图1 流动相对利塞膦酸钠、2（-3-吡啶）乙酸的保留与分离的影响a.利塞膦酸钠；b.2（-3-吡啶）乙酸Fig 1 Influences of the mobile phase on the retention and separation of RS and 2-（3-pyridine）acetic acida.RS；b.2（-3-pyridine）acetic acid

由图1A可知，随着流动相pH值的增加，利塞膦酸钠、2-（3-吡啶）乙酸在柱上保留都增加；当pH≥7.0时，2-（3-吡啶）乙酸的保留因子k＞1，说明只有在较高pH条件下，2-（3-吡啶）乙酸才以阴离子状态存在，从而可以与四丁基铵阳离子形成中性离子对，在C8柱上得到良好的保留。兼顾到合适的保留时间与良好的分离情况，最终选择pH 7.0作为分离条件（当pH＞7.0时，流动相对C8柱的损害较大）。

（2）离子对试剂浓度的影响。当磷酸二氢钠缓冲液浓度（5 mmol/L）、流动相pH值（7.0）及甲醇的体积分数（20%）一定时，离子对试剂四丁基溴化铵浓度为0～8 mmol/L时对利塞膦酸钠和2-（3-吡啶）乙酸保留行为的影响见图1B。

由图1B可以看出，随着四丁基溴化铵浓度的增加，二者的保留都呈现出增加的趋势。当四丁基溴化铵浓度大于6 mmol/L时，利塞膦酸钠保留增加趋于缓慢。同时四丁基溴化铵浓度的增加改善了利塞膦酸钠峰形的拖尾，说明四丁基溴化铵也起到了减尾剂的作用。考虑到利塞膦酸钠和2-（3-吡啶）乙酸的保留行为和峰形情况，最终选择四丁基溴化铵的浓度为6 mmol/L，在此条件下，二者分离良好，利塞膦酸钠峰的拖尾因子为1.05。

（3）有机改性剂比例的影响。当四丁基溴化铵的浓度（6 mmol/L）、磷酸二氢钠缓冲液浓度（5 mmol/L）及流动相pH值（7.0）一定时，加入体积分数为5%～25%的甲醇，考察其对利塞膦酸钠和2-（3-吡啶）乙酸保留行为的影响，结果见图1C。

图1C结果表明，随着甲醇体积分数的增加，流动相的极性减小，洗脱能力增强，利塞膦酸钠和2-（3-吡啶）乙酸的保留均减弱。兼顾到合适的保留时间与分离情况，最终选择甲醇的体积分数为20%。

（4）缓冲液浓度的影响。在6 mmol/L四丁基溴化铵及20%甲醇条件下，浓度为5～50 mmol/L的磷酸盐（磷酸二氢钠）缓冲液对利塞膦酸钠和2-（3-吡啶）乙酸保留行为的影响见图1D。

由图1D可知，随着磷酸盐缓冲液浓度的增加，二者的保留均减弱。为了保证良好的分离及合适的保留时间，最终选择磷酸盐缓冲液的浓度为5 mmol/L。

在上述试验确定的优化条件下，采用C8色谱柱，取利塞膦酸钠对照品、2-（3-吡啶）乙酸对照品、注射用利塞膦酸钠（批号：20110811）、利塞膦酸钠注射液（批号：20120107）、经氧化破坏的利塞膦酸钠注射液样品（批号：20120107）及经紫外灯（40 W，照射6 d）照射后的利塞膦酸钠注射液样品（批号：20120107）水溶液进样，结果见图2。

图2 高效液相色谱图A.利塞膦酸对照品；B.2-（3-吡啶）乙酸对照品；C.注射用利塞膦酸钠；D.利塞膦酸钠注射液；E.氧化破坏后的利塞膦酸钠注射液；F.紫外照射后的利塞膦酸钠注射液；a.利塞磷酸钠；b.2-（3-吡啶）乙酸；c～e.其他氧化分解产物Fig 2 HPLC chromatogramsA.control of RS；B.control of 2-（3-pyridine）acetic acid；C.RS for injection；D.RS injection；E.injection samples destroyed by oxidation；F.injection samples after ultraviolet radiation；a.RS；b.2-（3-pyridine）acetic acid；c-e.other products of oxidation and decomposition

由图2可见，2-（3-吡啶）乙酸和利塞膦酸钠的保留时间分别约为3.0、7.8 min，9 min内即可完成一次进样分析；且利塞膦酸钠与有关化合物的分离情况良好，与保留时间最接近的杂质峰的分离度大于2.5。

3 讨论

双膦酸类药物（包括双膦酸和双膦酸盐）是一类含有P-C-P键的化合物，含有2个膦酸基团，因而极性很强，不能在C8、C18等非极性色谱柱上保留，其色谱分析方法多采用离子交换HPLC法[1-8]。双膦酸类化合物是四元酸，存在多级电离，在离子交换HPLC法中为了保证其以单一的电离形式保留，需要采用强碱或强酸性流动相，因而这些方法大多以价格昂贵的耐强碱或耐强酸的阴离子交换柱为固定相；且需要梯度洗脱，分离效果及重现性差，操作烦琐耗时，分析成本高，难以在药品的常规分析中应用。

本文建立的离子对RP-HPLC法，通过在流动相中加入离子对试剂四丁基溴化铵，使得利塞膦酸钠及其有关物质在反相色谱柱上保留，并通过优化色谱条件，采用等度洗脱方式便达到了很好的分离及含量测定效果；且方法可靠、简单，不需要复杂的样品处理过程，故适用于利塞膦酸钠原料药及其制剂的常规检验。

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