痛风性关节炎动物模型制备的研究

李 泽，张记恩，荣 俊 （长江大学临床医学院，湖北 荆州434000）

痛风性关节炎是由于尿酸纳结晶体沉积在关节腔内引起的一种炎症反应，临床上以肿胀、疼痛、发热为主要表现［1］。目前，痛风性关节炎的发病率逐渐上升，发病低龄化，对其病因与遗传学的研究及临床治疗逐渐成为大家重视的问题。但目前痛风性关节炎的动物模型的制备尚不成熟，与人类痛风性关节炎的发病机制相比稳定性较差。本实验依据Mc Carty法造模，建立SPF鸡痛风模型，评估人工痛风模型建立的效果，以便对新型药物治疗痛风提供实验室依据，并为临床上治疗痛风性关节炎提供新的方向和参照。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF白来航鸡30只 （雄性），鸡龄2～3月，体质量1800～2500g，代谢笼：由本院提供。实验室：温度湿度稳定、干洁、通风。实验前实验室标准条件下常规饲养1周。

1.1.2 主要药物 尿酸钠晶体Sigma公司生产；生理盐水 （美国Aldrich公司）；PZA （美国Sigma公司）；苯溴马琏 （德国赫曼大制药厂）。

1.2 动物分组与给药方法

SPF鸡实验室标准条件下常规饲养1周。SPF鸡30只随机分为两组，模型组25只和正常对照组5只。采用Mc Carty经典方法造模，即将SPF鸡腿部备皮 （左侧），常规消毒皮肤，轻度屈曲关节，关节正中进针，将配置好的2%尿酸钠溶液以0.5ml／kg通过膝关节后侧韧带注入公鸡膝关节腔。正常对照组注射等容积生理盐水。每3d注射1次，连续注射4次。于注射前、注射后5、24、48h后仔细观察受试关节的形态变化 （局部红肿程度、皮肤温度变化、关节活动度），分别详细记录以上4个阶段时受试关节患侧、健侧的周径及皮肤温度差值。第6周取血后处死SPF鸡，按外科学钝性分离法取出受试鸡健、患侧膝关节软骨及滑膜组织，切成约1mm厚的切片行病理学检查。

1.3 观察指征

①精神状态以及活动情况，饮食、体质量、毛色、皮温、关节皮色、肿胀程度、行走状况和关节液变化情况等等。②膝关节周径的测量以及肿胀指数的计算。③光学显微镜下观察关节滑液细胞种类及数量以及变化情况。④病理学报告以及炎症程度记分。

2 结 果

2.1 一般情况观察

实验前1周模型组和正常对照组精神好，食欲佳，活泼好动，毛色光泽，体质量按正常增长。局部常规注射尿酸盐后，模型组鸡皮毛干枯发黄，倦怠懒动缓慢，进食逐渐量少，出现便秘2只，体质量逐渐下降3只，其余7只体质量增长缓慢。用药后观察1～6h，模型组鸡活动、摄食水明显减少，关节局部肤温升高，正常对照组于实验前无明显差异；模型组与实验前相比变化显著。正常对照组5只步态均为0级，而模型组25只步态呈现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别为12、6、7只，无0级步态。

图1 正常软骨组织

2.2 两组关节周径变化

两组关节周径变化见表1。正常对照组用药前后关节周径差异无统计学意义（P＞0.05），模型组用药后周径增加明显，用药前后比较有统计学差异（P＜0.05）。模型组关节周径增加明显，高于正常对照组（P＜0.05），表明局部注射尿酸盐较好地复制痛风模型。

表1 造模前后各组关节周径变化

2.3 组织病理改变

正常对照组：病理学改变不明显，关节周围组织结构正常 （见图1、2、3）。

模型组：明显的关节炎病理改变，关节周围异物肉芽肿形成，其间有大量异物多核巨细胞，成纤维细胞增生，毛细血管增生，排列紊乱。尿酸盐结晶可在标本取出时大体观察到 （如图4、5）。

图3 正常肾小管上皮细胞

图4 病变软骨组织

模型组电镜显示：肾近曲小管上皮细胞结构紊乱，细胞表面微绒毛形态不规则；正常对照组：肾小管上皮细胞线粒体结构正常 （图6）。X线下可见：正常对照组关节间隙正常，无钙化影，无骨质破坏，关节面平整 （图7）；模型组可见关节间隙狭窄，骨质破坏，可见不规则团块状钙化影 （图8）。

图5 病变滑膜组织

图6 病变肾小管上皮细胞

图7 正常X线表现

图8 病变X线表现

2.4 血尿酸水平的变化

用药前，各组SPF鸡血尿酸水平无统计学差异（P＞0.05）。用药后，模型组SPF鸡血尿酸值由（108.9±10.11）μmol／L升高到 （301.8±24.7）μmol／L，与用药前比较均有统计学差异 （P＜0.05）。表明局部注射尿酸盐可以复制痛风发作模型，为临床治疗痛风打下实验基础。

3 讨 论

痛风是一种代谢性疾病。成人血尿酸的正常浓度为90～420μmol／L，其水溶性差，超过此范围即会形成结晶，沉积后引起一系列临床症状。近年来，随着痛风发病率的逐年增多，对痛风的研究日益受到重视。

尿酸是天然抗氧化剂的代表。施心猷等［2］研究证实其保护脏器、血管内皮细胞DNA，延缓器官老化，根本原因是它可以清除氧自由基。同时可以延迟淋巴细胞的凋亡，增强机体免疫力。杨春生等［3］在临床工作中还发现高尿酸血症与慢性疾病有关，例如高血压、冠心病等。所以对高尿酸血症的研究临床综合治疗和研究各种医学现象有重要意义。痛风是由于尿酸代谢失衡的结果，如尿酸产生过多和／或排泄减少，使血尿酸在血液中蓄积，就会引发痛风的相关症状。由于体内存在尿酸酶，所以人类与SPF鸡在尿酸代谢方面存在着显著差异。因此只有消除这种差异才能达到动物模型与人类痛风相似的目的，目前主要的方法是破坏胚胎干细胞的尿酸酶基因，从而引发痛风，但是由于这种方法使动物肾脏损害非常严重，因此死亡率高，此外，这种方法操作复杂，技术要求高，限制了其应用和发展。因此应用尿酸酶的方法建立痛风模型成为主要方法，但依然与人类疾病有着重要差别。

动物模型的建立是寻求新型治疗药物和探究疾病机理的有效途径，而建立可靠的高尿酸血症动物模型是研究痛风及其相关疾病发病、新型治疗方法的基础［4］。因此对于痛风的研究也应建立在动物模型的基础之上，它是寻找新型治疗方案的基础。动物模型设计［5］应首先遵循可靠、适用、相似、再现、可控及易行性等原则，而评价则从模型症状、表现、病理变化、反证治疗以及模型稳定性等方面进行。周小舟等［6］研究发现人类缺乏尿酸酶基因，从而导致体内缺乏尿酸酶，而大多数动物包括哺乳类动物体内普遍存在尿酸酶，能将尿酸进一步分解为尿囊素，尿囊素无毒、水溶性良好，极易随尿排出体外，所以血尿酸水平较低。尿酸是人类嘌呤核苷酸代谢终产物，如果嘌呤代谢发生障碍往往会伴随血尿酸水平升高。国内外大量研究［7］证实，人类和禽类嘌呤核苷酸的代谢途径极其相似，其终产物尿酸的合成和代谢方面与有共同之处 （核酸在降解过程中也能产生嘌呤类化合物，最终生成血尿酸），所以伴随饮食中蛋白质和核蛋白增加时，体内尿酸的生成随之增加。在动物选择方面，除了种属之外，还包括性别以及年龄。国内学者何力群实验证明雌雄动物无明显差异［8］，但是在实际操作中，一般选用雄性动物，因为同性动物之间，血尿酸正常值差异较大，雌鼠尤为明显，这可能与雌性动物激素分泌波动有关。为消除年龄因素，在实验中通常选用机体各项机能正常的年轻动物。SPF鸡饲养方便，是常用的实验用动物。

我们将一定浓度的尿酸钠液注入关节腔造成急性痛风性关节炎模型，其局部表现、关节液检查和病理与人类疾病极为相似。在1961年，有研究证实MSU晶体存在于痛风患者关节内，并把尿酸钠晶体注入狗的关节后成功的诱发急性关节炎，标志着痛风研究史上的里程碑［9］。MSU诱发的急性突发性关节炎是国际上常用的GA模型［10］。尿酸在体液中的溶解度很低 （尿酸最高溶解度是0.385mmol／L），在它饱和后会形成结晶，结晶以尿酸盐的形式沉积于正常含有大量粘多糖的结缔组织中，如关节软骨内、滑膜内和其他组织，由于这些组织中血管存在较少，组织液pH比较低，便于尿酸盐沉积。实验证实鸡膝关节腔内注入配置好的MSU液后，关节炎症状迅速出现［11］。药物注射后4h后关节炎已经有明显表现，关节腔积液和关节周围组织含有大量的炎症细胞浸润。实验表明，注射后4h与注射后12、24、48h鸡膝关节皮肤温度差异显著。其关节肿胀与跛行步态可在48h内自行轻微缓解。为达实验目的，使其更符合人类痛风性关节炎的特性，故反复注射。

通过实验可观察到模型组用药后鸡单侧的膝关节肤温升高，局部红肿较明显，关节液质浊、量多、色浅微黄，关节周径增大，食量减少，伴随明显的跳跃步态。病理组织改变明显，光学显微镜下可见尿酸钠晶体沉积于关节及其周围，血液分析可见白细胞明显增多，与对照组相比，有统计学意义（P＜0.05），说明尿酸钠诱导的急性痛风性关节炎模型造模成功。本实验通过 （单侧膝关节）腔隙注射尿酸钠溶液，建造出较为成熟稳定的急性痛风性关节炎的动物模型，给痛风性关节炎的研究、寻找新的抗痛风药物以及抗痛风药物的作用带来参考和对照。