卡维地洛对RyR2介导的自发性钙振荡的抑制作用*

肖建民， 付 晖

(1东莞市太平人民医院心血管内科，广东东莞523905;2广东医学院药理教研室，广东 东莞523808)

越来越多证据显示，自发性钙振荡是心衰时发生心律失常及泵衰竭的重要机制之一。心衰时经心肌细胞肌浆网上的钙释放通道——兰尼定受体2(ryanodine receptor 2，RyR2)产生的自发性钙释放(spontaneous calcium release)明显增多［1-2］。增强的自发性钙释放活性能激活内向电流，如Na+/Ca2+交换电流，这种钙激活的内向电流能改变细胞膜电位，进而产生延迟后除极(delayed afterdepolarization，DAD)及触发性心律失常，诱发恶性心律失常［3］。因此，心肌细胞肌浆网上的RyR2功能失调所致的钙稳态失衡在恶性心律失常发生中扮演着重要角色，是心衰时患者死亡的原因之一［4］。β肾上腺素受体阻滞剂是慢性心衰的标准治疗药物，通过阻滞交感神经及儿茶酚胺活性以抑制心律失常及心室重构。多项临床研究证实，β受体阻滞剂可以降低心衰患者死亡率，但并非所有β受体阻滞剂在降低心衰死亡率上都具有同等效果，其具体原因目前还不清楚。

COMET研究显示，卡维地洛降低心衰死亡率的效果明显优于美托洛尔。一般认为，卡维地洛的优势源于其抗氧化作用及对α1和β1受体的非选择性作用［5］。但是否还有别的机制参与其中，例如卡维地洛对自发性钙振荡有没有影响，目前还未见报道。本研究采用急性分离的大鼠心肌细胞和构建能稳定表达RyR2的HEK293细胞株，并以胞内钙影像技术检测卡维地洛和其它14种常用的β受体阻滞剂如美托洛尔、索他洛尔、纳多洛尔等对心肌细胞和HEK293细胞的RyR2介导的胞内钙振荡的影响。结果证实卡维地洛是唯一可以抑制RyR2介导的自发性钙振荡的β受体阻滞剂，这可能是卡维地洛在降低心衰死亡率上优于其它β受体阻滞剂的机制之一。

材料和方法

1 试剂和溶液

胶原酶、DNA连接酶、切割酶及卡维地洛和美托洛尔均购自Sigma。KRH缓冲液:125 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1.2 mmol/L KH2PO4，6 mmol/L glucose，1.2 mmol/L，MgCl2，25 mmol/L HEPES，pH 7.4。PBS 液:137 mmol/L NaCl， 8 mmol/L Na2HPO4，1.5 mmol/L KH2PO4和 2.7 mmol/L KCl。常规试剂均为分析纯。

2 方法

2．1 构建可稳定诱导表达RyR2的HEK293细胞株 首先在CMV启动子下游，将RyR2 cDNA克隆进可经四环素诱导表达的载体(pcDNA5/FRT/TO)中，然后采用Flp-In T-REx Core Kit(Invitrogen)构建可稳定诱导表达RyR2的HEK293细胞株。简单而言，用磷酸钙沉淀法，将可诱导表达RyR2的pcDNA5/FRT/TO质粒和可表达翻转酶(flippase，Flp)重组酶的pOG44质粒以1∶5的比例共同转染Flp-In T-Rex-293细胞(Invitrogen)。转染24 h后，用PBS液轻轻清洗细胞并更换新鲜培养液。再经24 h后，用PBS液将培养皿中的细胞洗脱并转入新的培养皿中。待细胞贴壁后(约4 h)，将培养液更换为含有200 mg/L潮霉素(Invitrogen)的细胞选择性培养液。每3～4 d更换1次潮霉素培养液，直到细胞生长到足够的密度。收集分装这些抗潮霉素的HEK293细胞，保存于－80℃备用。因为RyR2 cDNA由Flp重组酶介导、在同一个唯一的Flp重组酶作用靶点(Flp recombination target，FRT)插入 Flp-In T-Rex-293细胞基因组中，所以这些细胞具有良好的同源性。最后采用Western blotting检测RyR2在HEK293细胞株中的表达状况。

2．2 HEK293细胞株的钙影像 采用单细胞钙影像技术和钙离子荧光示踪剂Fura-2 AM检测表达RyR2的HEK293细胞的胞内钙振荡。在盖玻片上培养HEK293细胞株，以1 kg/L四环素(Sigma)诱导表达24或30 h后，在常温下(22℃)，用含5 mol/L Fura-2 AM及0.02%普卢兰尼克F-127和含0.1 g/L BSA的KRH缓冲液孵育细胞20 min。将盖玻片固定于特制灌流槽(Warner Instruments)后置于装有S-Fluor 20x/0.75物镜的倒置显微镜下(Nikon TE2000-S)，以含1 mmol/L CaCl2的KRH液持续灌流细胞，诱发自发性钙振荡。每4 s曝光1次，记录Fura-2荧光强度(0.33 frames·s－1)。选定单个细胞，在其中心区域检测荧光强度的变化，并以 SimplePCI 6软件(Compix)对影像进行分析。测定药物作用时，在灌流液中加不同浓度的β受体阻滞剂，比较加药前后钙振荡的变化。实验最后以10 mmol/L咖啡因灌流细胞，以证实HEK293细胞中有具功能活性的RyR2表达。只有那些对咖啡因有反应的细胞才能用作检测和数据分析。

2．3 酶解分离大鼠心肌细胞 实验动物均由广东医学院实验动物中心(编号为SCKK-2008-0008)提供。如文献所述［6］，采用酶解分离获取单个大鼠心肌细胞，并在室温下(22℃)将细胞保存于含20 mmol/L牛磺酸、5 g/L白蛋白和0.5 mmol/L CaCl2的KRH缓冲液中备用。

2．4 心肌细胞钙影像 将用0.02%(W/V)明胶和10 kg/L纤维连接素处理过的玻璃盖片固定于灌流槽(Warner Instruments)上。常温下(22℃)，将心肌细胞置于玻璃盖片上，用含5 mmol/L Fluo-4 AM及0.02% 普卢兰尼克F-127和1 mmol/L CaCl2的KRH缓冲液孵育细胞20 min。从1 mmol/L起逐步缓慢提高灌流液中钙离子浓度至6 mmol/L，然后以含6 mmol/L CaCl2的KRH液持续灌流细胞，以诱发心肌细胞自发性钙震荡。采用装有S-Fluor 20x/0.75物镜的倒置显微镜(Nikon TE2000-S)，每0.4 s曝光1次，记录Fluo-4荧光强度(1.68 frames·s－1)。选定单个细胞，在其中心区域检测荧光强度的变化，并以SimplePCI 6软件对影像进行分析。测定药物作用时，在灌流液中加不同浓度的β受体阻滞剂，比较加药前后钙振荡的变化。其余同2．2。

3 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件分析。数据用均数±标准误(mean±SEM)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HEK293细胞中RyR2的表达

如图1所示，在构建可稳定诱导表达RyR2的HEK293细胞株后，我们采用Western blotting方法检测了RyR2蛋白在HEK293细胞上的表达效率，并与心肌细胞对比。结果发现，按照前文2．1所示方法可建立稳定表达RyR2的HEK293细胞株，其RyR2蛋白含量与心肌细胞无明显区别。

Figure 1．The expression of RyR2 in HEK293 cell line and ventricular myocytes．图1 HEK293细胞株和心肌细胞上RyR2的表达

2 卡维地洛而非美托洛尔可明显抑制心肌细胞自发性钙振荡

卡维地洛可浓度依赖性地抑制心肌细胞的自发性钙振荡。卡维地洛1、3、10、30和60μmol/L对心肌细胞自发性钙振荡的抑制率分别为(10.10±1.20)%、(34.57±3.50)%、(52.31±4.70)%、(65.30±2.30)%和(86.84 ±3.20)%。美托洛尔1、3、10、30 和60μmol/L对心肌细胞自发性钙振荡的抑制率分别为(0.44±0.12)%、(0.80±0.10)%、(6.46±0.50)%、(16.04±1.20)%，明显低于同等剂量下卡维地洛的作用。我们继续加大美托洛尔的剂量，发现美托洛尔100μmol/L和300μmol/L对心肌细胞自发性钙振荡的抑制率仍比较低，分别为(19.25±0.70)%和(26.28±1.90)%。2组相比，各个浓度值差异均有统计学意义(P＜0.01)，见图2。

3 卡维地洛而非美托洛尔可明显抑制表达RyR2的HEK293细胞株的自发性钙振荡

卡维地洛可浓度依赖性地抑制HEK293细胞株的自发性钙振荡。卡维地洛1、3、10、30和60μmol/L对表达RyR2的HEK293细胞株自发性钙振荡的抑制率分别为(1.50±0.10)%、(7.49±1.50)%、(34.72±4.20)%、(69.08±5.30)%和(97.49±6.20)%，而美托洛尔 1、3、10、30 和 60 μmol/L 对HEK293细胞株自发性钙振荡的抑制率在所检测的各个浓度均为0。我们继续加大美托洛尔的剂量，发现在HEK293细胞株，即使美托洛尔浓度升高至300 μmol/L仍不能抑制自发性钙振荡。2组相比，各个浓度值差异均有统计学意义(P＜0.01)，见图3。

Figure 2．Effects of carvedilol and metoprolol on the spontaneous calcium release in ventricular cardiomyocytes．Cells were treated with carvedilol at 1，3，10，30 and 60 μmol/L(A，1 μmol/L is not shown)and metoprolol at 1，3，10，30，60，100 and 300 μmol/L(B，1 and 60μmol/L are not shown)．Carvedilol can significantly suppress the spontaneous calcium release，but metoprolol has no obvious effect on the spontaneous calcium release(C)．Mean±SEM．＊＊P ＜0.01 vs metoprolol．图2 卡维地洛和美托洛尔对心肌细胞自发性钙释放的作用

Figure 3．Effects of carvedilol and metoprolol on the RyR2-mediated spontaneous calcium release in HEK293 cell line．Cells were treated with carvedilol at 1，3，10，30 and 60μmol/L(A，60μmol/L is not shown)and metoprolol at 1，3，10，30，60，100 and 300 μmol/L(B，1 and 60μmol/L are not shown)．Carvedilol can significantly suppress the spontaneous cal-cium release，but metoprolol has no effect on the spontaneous calcium release(C)．Mean±SEM．＊＊P ＜0.01 vs metoprolol．图3 卡维地洛和美托洛尔对RyR2介导的HEK293细胞株自发性钙释放的作用

4 各种不同β受体阻滞剂对心肌细胞及表达RyR2的HEK293细胞株自发性钙振荡的影响

进一步分别检测30μmol/L卡维地洛、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、醋丁洛尔、烯丙洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、拉贝洛尔、吲哚洛尔和噻吗洛尔等14种β受体阻滞剂对心肌细胞和表达RyR2的HEK293细胞株自发性钙振荡的抑制作用。如图4所示，各种不同β受体阻滞剂中仅卡维地洛可以明显抑制心肌细胞和HEK293细胞株自发性钙振荡，其它13种β受体阻滞剂仅有轻微抑制或完全没有作用。

Figure 4．Effects of various kinds ofβ-blockers(30μmol/L)on spontaneous calcium release in ventricular cardiomyocytes(A)and HEK293 cells(B)．Only carvedilol can inhibit spontaneous calcium release in both cells．1:acebutolol;2:alprenolol;3:atenolol;4:betaxolol;5:bisoprolol;6:carvedilol;7:esmolol;8:labetalol;9:metoprolol;10:nadolol;11:indolol;12:propranolol;13:sotalol;14:timolol．Mean±SEM．n=246 in carvedilol group;n=200 in other groups．图4 30μmol/L各种β受体阻滞剂对心肌细胞和HEK293细胞株自发性钙释放的作用

讨 论

1999年和2001年公布的 CIBIS II、MERIT-HF和COPERNICUS研究分别证实了比索洛尔、琥珀酸美托洛尔和卡维地洛可以降低慢性收缩性心力衰竭总死亡率34% ～35%，被认为是里程碑式的研究，奠定了β受体阻滞剂在慢性收缩性心力衰竭治疗中的坚实地位［7-9］。

然而，并非所有β受体阻滞剂均能获得相同的疗效。在BEST研究［10］中采用具有α阻断作用的非选择性β受体阻滞剂布新洛尔治疗慢性心力衰竭，其结果并不优于安慰剂。在COMET研究［5］中，卡维地洛比酒石酸美托洛尔更好地降低死亡率。而且，在不同收缩压、心率和β受体阻滞剂剂量情况下，接受卡维地洛治疗的患者死亡率均显著低于接受美托洛尔治疗的患者;无论血浆氨基末端脑利钠肽前体的浓度如何，卡维地洛治疗均比美托洛尔有优势;从美托洛尔转换到卡维地洛，相比从卡维地洛转换到美托洛尔，其严重不良事件、死亡率和住院率均较低。虽然以上多项临床研究都证实卡维地洛优于美托洛尔，但其具体机制还未阐明。有报道卡维地洛对肾上腺素受体的非选择性阻断及其抗氧化作用可能是原因之一［11］，是否还存在其它机制目前还不清楚。

本实验采用钙影像技术检测了卡维地洛、美托洛尔等多种β受体阻滞剂对心肌细胞自发性钙振荡的作用，结果发现相对于其它14种β受体阻滞剂，卡维地洛可明显抑制心肌细胞的自发性钙振荡。由此我们首次提出了卡维地洛特有的对心肌细胞自发性钙振荡的抑制作用。

心肌细胞内钙稳态的维持及自发性钙振荡的发生涉及多个环节，研究证实，RyR2功能失调在自发性钙振荡的发生中扮演着重要角色，是心衰时发生恶性心律失常导致死亡的原因之一［12-14］。为进一步证实卡维地洛对心肌细胞自发性钙振荡的抑制是不是由RyR2介导，我们制备了表达RyR2的HEK293细胞株，发现在所有检测的14种β受体阻滞剂中，发现只有卡维地洛能抑制表达RyR2的HEK293细胞株的自发性钙振荡。在前期实验中，我们发现卡维地洛急性灌流并不能改变HEK293细胞株上RyR2的表达(结果中未显示)，而本实验发现同样给药方式下卡维地洛可明显抑制表达RyR2的HEK293细胞株的自发性钙振荡，提示卡维地洛急性给药主要影响RyR2的功能，而对其含量和表达无显著影响。由此证实RyR2是卡维地洛抑制心肌细胞自发性钙振荡的靶点。

综上所述，本研究发现，在所检测的14种β受体阻断剂中，只有卡维地洛能够抑制RyR2介导的心肌细胞自发性钙振荡，提示卡维地洛对自发性钙振荡的独特作用可能是卡维地洛降低心衰死亡率的效果明显优于美托洛尔等其它β受体阻滞剂的原因之一，同时也为心衰时针对RyR2这一靶点的抗心律失常治疗提供了新的理论基础。