不同平衡时间对獭兔精液冷冻保存效果的影响

田秀娥，蔺晓舟

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

獭兔是一种典型的毛皮用兔，因其毛皮酷似珍贵的水獭，因而被群众称为獭兔或天鹅绒兔。在规模化的獭兔饲养中，为了克服其季节性繁殖的限制，提高优良种公兔的使用年限，利用冷冻精液进行人工授精无疑是达到这一目的的有效途径。在精液的冷冻保存过程中，影响保存效果的因素较多，其中平衡时间为影响因素之一。

在家畜精液冷冻保存中，精液经稀释后缓慢降温至4～5 ℃，并在此环境中放置一定时间，以增强精子的耐冻性，这个处理过程叫做平衡，是精液冷冻保存过程中必不可少的环节之一。平衡时间的长短在不同动物和不同国度也不尽一致，与动物种类、稀释液种类、冷冻速度、冷冻方法等因素相关[1-3]。辛国省[4]、郑筱峰等[5]报道认为，藏獒精液冷冻保存时平衡最佳时间为15～20 min；姜兴刚[6]研究表明，猪精液冷冻保存的平衡最佳时间为60 min；有关牛精液冷冻保存的平衡最佳时间不同研究结果差异较大，从3 h[7]到4～5 h[8]，再到7.5 h[9]不等。关于家兔精液冷冻保存时最佳平衡时间，杨素芳[10]认为平衡时间以30～60 min较好，但罗光彬等[11]认为最佳平衡时间为90 min。另外，赵建军等[12]研究表明，平衡时间并不影响精液冷冻保存效果。

因此，关于平衡时间对动物精液冷冻保存效果的研究结果不仅不同物种间的差异较大，而且对于同一物种的研究结论也不尽相同。由于兔冻精在多产多育方面效果比鲜精差[13]，因而兔的人工授精多用鲜精或是短期储存的精液，其结果是极大限制了优秀公兔种用价值的利用。为了大力推广使用兔冷冻精液的人工授精，充分提高种公兔的利用率，制作品质优良的獭兔冷冻精液是其必不可少的前提，而平衡时间的长短是影响精液冷冻保存效果的因素之一。试验将采精的獭兔鲜精混合精液经精液品质检查、稀释后平均分为4份，分别平衡30、60、90、120 min后分装、冷冻，解冻后检查精液品质，探究不同平衡时间对獭兔精液冷冻解冻后品质变化的影响，以筛选出最佳的平衡时间。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物 试验用獭兔为身体健康的成年公兔5只，采用单笼饲养，定时、定量饲喂全价饲料，自由饮水。

1.1.2 主要仪器设备 兔用假阴道、显微镜(13395H2X，Leica Microsystems Inc，USA)、恒温水浴锅(精宏)、座式自动电热压力蒸汽灭菌锅、冰箱(海尔BCD-213G)。

1.1.3 主要试剂药品 Tris(1kg, SIGMA,批号：1001318282)；柠檬酸(500 g，四川西陇化工有限公司，批号：100705)；丙三醇(500 mL，西安三浦精细化工厂，批号：20091122)；葡萄糖(500 g，天津市登丰化学品有限公司，批号：20100618)。

1.2 方 法

1.2.1 试验用基础液及稀释液的配制 按Tris 30.3 g/L，柠檬酸16.8 g/L，葡萄糖12.5 g/L配制好基础液，消毒灭菌后置5℃冰箱中保存备用。采精前取出基础液，分别加入卵黄(200 mL/L)，青霉素(1.0×106IU/L)，链霉素(1.0×106IU/L)及8%的甘油，混匀后预热至30 ℃用于稀释品质合格的精液。

1.2.2 精液采集、稀释、冷冻与解冻 用自制兔用假阴道采集5只公獭兔的精液并混合，运回实验室然后检查精液品质。当色泽乳白、无异味、密度适中、pH在7.0～7.5之间、活率在80%以上，则用预热的稀释液以1∶1的比例稀释原精，轻摇混匀后均分成4份，移入4只已编号的试管内。用16层以上纱布包裹，置于5 ℃冰箱中缓慢降温平衡，分别平衡30 min、60 min、90 min、120 min，即试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组。平衡后装入0.25 mL的细管中，封口后于距液氮表面3 cm处熏蒸8 min，移至液氮罐中冷冻保存。解冻时，将从液氮罐中取出的细管立即放入40 ℃恒温水浴锅中，约3秒后取出立即检查精液品质，每个细管每个指标均检测3～4次，将其平均数作为一次重复，试验共进行了3次重复。

1.2.3 精液品质检测指标及方法

1.2.3.1 精子活率 采用伊红试剂染色法测定，每次计数400个精子。计算公式：

活率=未着色精子数/总精子数；

1.2.3.2 畸形率 采用伊红试剂以1∶1的比例对解冻后的精液进行染色，并制备成抹片，每次计数400个精子。计算公式：

畸形率=畸形精子数/计数精子总数×100%

1.2.3.3 精子质膜完整率 采用低渗膨胀试验测定精子质膜完整率。计算公式：

质膜完整率=弯尾精子数/计数总精子数×100%

1.2.3.4 精子顶体完整率 采用姬姆萨染色法测定精子的顶体完整率。计算公式：

精子顶体完整率=顶体完整型精子数/计数总精子数×100%

1.3 数据统计与分析方法

试验结果以平均数±标准差表示，用SPSS17.0中one way-AVOVA进行显著性检验，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

不同平衡时间对獭兔精液冷冻保存后精液品质的影响见表1、图1。从表1可知，平衡60 min的精子冻后活率显著高于30 min、90 min及120 min(P<0.05)；平衡60 min的精子畸形率显著低于30 min(P<0.05)，但与其他组无显著差异(P>0.05)；平衡30 min、60 min的精子质膜完整率显著高于120 min(P<0.05)，与90 min差异不显著(P>0.05)；组间精子顶体完整率差异均不显著(P>0.05)。

从图1可看出，随着平衡时间的延长，精子活率呈先增长、后下降的趋势，在平衡时间为60 min时的活率达到最高；精子的畸形率呈先降低趋于稳定的趋势，在平衡时间为60 min时的精子畸形率最低，其他几组畸形率均高于平均60 min组，表明平衡时间过短或过长都会使獭兔冷冻精液中畸形精子数上升，从而使精子的受精能力下降；精子的质膜完整率总体呈下降趋势，平衡30 min至60 min阶段下降较缓慢，超过60 min后下降较快；精子的顶体完整率随平衡时间的延长，呈先缓慢下降再趋于稳定的趋势，总体上受平衡时间的影响较小。表明这两个指标受平衡时间的影响较小，在精液品质分析选取指标时可以酌情取舍。

表1 不同平衡时间对冷冻精液品质的影响Table 1 Effects of equilibrium time on the quality of cryopreservation spermatozoa

注：同列不同小字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或未标注表示差异不显著(P>0.05)。

Note: Values with different letters within columns are significantly different(P<0.05)，those with the same letters or without a letters are not significant(P>0.05).

图1 不同平衡时间下精液品质的变化Fig.1 The variation of sperm motility rate under different equilibrium time

3 讨 论

关于平衡时间对冷冻精子保存效果的影响，不同的研究人员选取的测定指标不同，但均涉及了精子活率，如藏獒[4]、猪[6]、牛[7-8]等。郑筱峰等[5]在对藏獒精子冷冻保存的最佳平衡时间探究时，选择了活率、顶体完整率2个指标，不同平衡时间时这两个指标的显著性检验结果一致。本研究结果表明，随平衡时间的延长精子顶体完整率呈下降趋势，但未达显著水平，而活率在各组间差异较大，可能与物种及平衡时间的设置不同有关；安立龙等[14]在研究鸡的精液冷冻中，分析了活率和畸形率2个指标，根据所选的二个指标测得的最佳平衡时间与本研究结果一致；刘玉等[9]探究平衡时间对种公牛精子冷冻保存效果的影响时，测定了活率、畸形率、顶体完整率3个指标，结果发现畸形率受平衡时间影响不大，但随着平衡时间的延长，活率先上升后下降，顶体完整率下降。除畸形率外，其它2个指标与本研究结果基本一致。卢晟盛等[15]通过对活率、畸形率、质膜完整率、顶体完整率四项指标的综合评定，以确定食蟹猴精液最佳平衡时间。结果除活率外，其他指标随平衡时间变化(30 min、60 min、90 min、120 min)均不显著。

虽然上述研究人员的研究结果与本研究结果相比有的一致，有的不一致，但分析上述各研究人员的研究结果后不难发现，活率是每个试验研究中均涉及的指标，也是能反映各不同物种冻精品质变化的较好指标。充分反映出活率是评定精液品质最基本，也是最重要的指标之一，其他指标如畸形率、顶体完整率、质膜完整率的测定结果对精液品质的关系在各不同试验研究中结果不一，结合本试验的探究结果，认为除活率和畸形率外，其他指标不能及时灵敏地反映出精液品质变化情况。在探究平衡时间对精液冷冻效果时，为了减少试验工作量，仅测定活率这一个指标即可较为客观、准确地精液品质的变化情况。

杨素芳等[10]以家兔为研究对象，将其精液在4 ℃下平衡30、60、120、180 min，结果发现在30～60 mn之间，解冻后精子活率差异并不显著。随后陈玉等[16]将哈白兔精液置5 ℃冰箱平衡30、60、90、120 min，结果平衡30、60 min解冻后活率较好，但差异不显著，而平衡90、120 min效果很差，与本研究平衡30 min与60 min时冻后活率差异显著的结果不一致，其原因可能是兔品种不同、稀释液组成不同、稀释液中抗冻保护剂种类及添加剂量不同等所致。罗光彬等[11]将獭兔精液稀释后置于5 ℃的冰箱内分别平衡90、120、150、180 min，解冻后精子活率90 min组最高，其次120 min组、150 min组，180 min组最低，但各组间差异显著，认为90 min为最佳平衡时间，但作者并未继续探讨90 min以下平衡时间对獭兔精液冷冻保存效果的影响。在本研究中，平衡90 min以上的精液活率也呈下降趋势，与此研究结果基本一致。

精液经含有甘油的稀释液稀释后，需在4～5 ℃下静置一段时间，使甘油充分渗透进精子内，以达到抗冻保护作用，谓之平衡。精子经适当低温平衡后可增强其耐冻能力，减轻在冷冻过程中冰晶化对精子的损害。虽然关于平衡的机理至今尚不明确[1]，但若平衡时间过短或过长，都会降低精子的抗冻能力，提高在冷冻过程中冰晶化对精子的损害，从而最终导致冷冻解冻后精液品质的下降，上述试验及本研究结果均验证了这一结论。

4 小 结

活率是评定平衡时间对精液冷冻保存效果影响的较为客观且准确的指标，獭兔精液冷冻保存时合适的平衡时间为60 min。

参考文献:

[1] 高宏宝, 赵文魁, 陈玉芳, 等. 影响波尔山羊精液冷冻效果的因素分析[J]. 中国草食动物, 2001, 3(2):31-32.

[2] 杨利国.动物繁殖学[M]. 北京：中国农业出版社, 2008：180-181.

[3] 朱士恩.家畜物繁殖学[M]. 北京：中国农业出版社, 2009：200.

[4] 辛国省, 张 勇, 赵兴绪. pH值和含甘油稀释液平衡时问对藏獒精液冷冻保存活率的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2008, 44(7):15-17.

[5] 郑筱峰, 刘 栋, 武彩红, 等. 甘油浓度和平衡时间对藏獒精液冷冻效果的影响[J]. 江苏农业科学, 2010(5):296-297.

[6] 姜兴刚, 赵桂英, 和绍禹, 等. 冷冻前离心方法、平衡时间、甘油浓度对猪精子冷冻保存的影响[J]. 畜禽生产, 2008(6)：42-43.

[7] 乔建民, 苏满管. 晋南牛细管冷冻精液平衡时间与活力关系试验[J]. 黄牛杂志，1989(3)：42-43.

[8] 李晓东, 阿淑艳, 王希平, 等. 平衡时间对牛冷冻精液活力影响[J]. 黑龙江动物繁殖, 1996,4(1):18-19.

[9] 刘 玉, 张晓霞, 张海涛, 等. 延长平衡时间和提高冷冻保护剂的比例对牛冷冻精液冻后活力的影响[C]∥青岛：第六届全国低温生物医学及器械学术大会.农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心，北京奶牛中心, 2009:122-124.

[10] 杨素芳, 邹知明, 张 莹,等. 兔精液冷冻保存的初步研究[J]. 广西农业生物科学, 2006, 25(S):205-206.

[11] 罗光彬, 王宝生, 贾俊龙, 等. 甘氨酸及二甲基亚砜对冷冻保存兔精液活率的影响[J]. 沈阳农业大学学报, 2011-2012,42(6):733-735.

[12] 赵建军, 张 伟, 张兆旺. 冷冻稀释液渗透压、抗冻剂和平衡时间对鸡颗粒冻精冻后活率的影响[J]. 甘肃农业大学学报, 2006, 41(5):14-17.

[13] Viudes-de-Castro M P,Vicente J S.A simple method for freezing rabbit semen with successful results on fertility and prolificity[J], Animal reproduction science 1996, 44: 195-201.

[14] 安立龙,许英梅, 蔡小燕, 等. 平衡时间对鸡精液冷冻效果影响的研究[C]∥家禽研究最新进展：第十一次全国家禽学术讨论会论文集，1994-2013:188-191.

[15] 卢晟盛,李 林, 胡传活, 等. 不同甘油浓度与平衡时间对食蟹猴精液冷冻效果的影响[J]. 动物学杂志, 2008, 43(1):50-55.

[16] 陈 玉, 石德顺, 崔奎青,等.兔精液冷冻保存的研究[J]. 黑龙江动物繁殖, 2007, 15(3):1-3.