博落回提取物在仔猪生产中的应用效果研究

李美荃，张春勇，满 意，安清聪，陈克嶙，郭荣富

(云南农业大学 云南省动物营养与饲料重点实验室，云南 昆明 650201)

在现代仔猪生产中，由于大量使用抗生素导致药物残留和耐药性的问题备受社会关注，研究和使用抗生素替代品是改善仔猪健康和生产性能的有效途径之一博落回提取物。(MCE)主要成分-生物碱有很强的生物活性，具有抗菌、抗肿瘤、改善肝功能、抗疟、杀虫等功效。Pavel Kosina[1]研究表明，含有MCE、血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱等对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、无乳链球菌均具有一定的抑制作用。万学攀[2]用博落回生物碱分离得到的部分物质进行了抑菌活性的检测，以血根碱和白屈菜红碱为主要成分的混合物抑菌效果最好，除沙门氏菌外，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、多杀性巴氏杆菌、蜡样芽孢杆菌有很好的抑制效果。MCE中的血根碱有很强的广谱抑菌作用。何夏阳[3]在断奶仔猪饲粮中添加0.5 mg/kg血根碱显著提高了断奶仔猪平均日增重、降低了料重比和腹泻率。由于抗生素药物残留和耐药性问题而不能大量使用的情况下，植物提取物作为饲料添加剂使用是目前研究热点，而MCE作为仔猪抗生素替代品具有研究价值和应用前景。本试验旨在研究MCE对病原微生物的抑菌效力、细胞应激参数、断奶仔猪生产性能、血液免疫和抗氧化参数的影响，为MCE在断奶仔猪生产中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选用健康PIC五元仔猪60头，35日龄断奶，随机分成5个处理组，每组4个重复，每个重复3头。A组为对照组，饲喂基础日粮，B、C和D组分别饲喂添加2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、7.5 mg/kg MCE的试验日粮，E组饲喂添加50 mg/kg土霉素的试验日粮。试验期为35～60日龄。

本研究萃取的MCE经高效液相色谱法测定，生物总碱含量为64%，其中血根碱含量为45%，白屈菜红碱含量为19%。

选用大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌进行MCE抑菌效力试验。

选用猪皮肤成纤维细胞(由本实验室提供)，参照骆雪[4]方法，采用LPS诱导细胞建立应激模型。

1.2 基础日粮配制

以可消化氨基酸为基础，参照NRC(1998)猪营养需要和PIC五元杂交猪种营养需要量配制基础日粮，其组成及营养水平见表1。

1.3 饲养管理

仔猪自由采食和饮水，按种猪场常规饲养和免疫规程进行饲养管理。记录采食量。

1.4 测定指标与方法

试验开始和结束时，分别空腹称重和计算60日龄日增重、日采食量和料重比。60日年龄时，前腔静脉采血5 mL，制备血清备用。细胞培养液IgG、LSZ和血清IgG、LSZ、SOD、MDA、GSH-Px采用全自动生化分析仪测定，试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。参照骆雪等(2012)方法，测定MCE抑菌效力和MCE最小抑菌浓度。

表1 基础日粮与营养水平(风干基础)Table 1 Basal diet and nutrient levels (air-dry basis)

注：①预混料为每千克饲料提供：铁 120 mg；铜 200 mg；锰 80 mg；锌 100 mg；碘 0.3 mg；维生素A 12 000 IU；维生素D 3 000 IU；维生素E 28 IU；维生素K35 mg；维生素B13 mg；维生素B28 mg；维生素B62 mg；维生素B120.04 mg；泛酸 22 mg；胆碱 0.024 g；尼克酸 40 mg；生物素 0.2 mg；叶酸 1 mg。 ②消化能为计算值，其余为实测值。

Note:①The premix provided the following per kg of diet: Fe 120 mg;Cu 200 mg;Mn 80 mg;Zn 100 mg;I 0.3 mg;VA 12 000 IU;VD 3 000 IU;VE 28 IU;VK35 mg;VB13 mg;VB28 mg;VB62 mg;VB120.04 mg;pantothenic acid 22 mg;choline chloride 0.024 g;nicotinic acid 40 mg;biotin 0.2 mg;folic acid 1 mg;②DE was a calculated value，while the others were measured values.

1.5 试验数据处理与分析

试验数据采用SAS 8.2软件处理和分析，对试验数据进行方差分析，对差异显著者采用Duncan氏法进行多重比较。所有试验结果采用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 MCE的抑菌效力与最小抑菌浓度

2.1.1 MCE的抑菌效力 由表2可知，随MCE溶液浓度增大，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制效果增强,抑菌圈直径也逐渐增大见图1，MCE对4种细菌的抑制效果分别是：金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>沙门氏菌。

2.1.2 MCE的最小抑菌浓度 将MCE溶液按2 560 μg/mL、1 280 μg/mL、640 μg/mL、320 μg/mL、160 μg/mL、80 μg/mL、40 μg/mL的浓度梯度测定最小抑菌浓度，结果见表3。观察发现，MCE稀释度越大，肉汤越浑浊，说明细菌生长越多。MCE对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为1 280 μg/mL、1 280 μg/mL、2 560 μg/mL、2 560 μg/mL。

表2 不同浓度博落回提取物对肠道微生物抑制效果(抑菌圈直径，mm)Table 2 Different concentrations of Macleaya cordata extract inhibited the intestinal microbiota (diameter of inhibited halo, mm)

图1 不同浓度博落回提取物对肠道微生物抑制效果(抑菌圈直径，mm)Fig.1 Different concentrations of Macleaya cordata extract inhibited the intestinal microbiota (diameter of inhibited halo, mm)

注：A:大肠杆菌；B：沙门氏菌；C：金黄色葡萄球菌；D枯草芽孢杆菌

Note:A:Escherichiacoli;B:Salmonella;C:Staphylococcusaureus;D:Bacillussubtilis

表3 MCE的最小抑菌浓度Table 3 Macleaya cordata extract minimum inhibitory concentration determination

注：“-”表示没有长菌，“+”表示少量长菌，“++”表示适度长菌，“+++”表示大量长菌。

Note:“-”means no bacteria,“+”means a small amount of bacteria,“++”means bacteria modest,“+++”means a large number of long-bacteria.

2.2 MCE对断奶仔猪生产性能的影响

由表4可知，35～60 d，C组日采食量比对照组提高了6.7%(P<0.05)，B组与C组日采食量差异不显著(P>0.05)；C组日增重比对照组提高了9.0%(P<0.05)，B组与C组日增重差异不显著(P>0.05)；B、C组料重比显著低于A、D、E组(P<0.05)。

表4 饲粮添加MCE对断奶仔猪生长性能的影响Table 4 Effects of Macleaya cordata extract on the growth performance for weanling piglets kg

注：同行数据肩标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。

Note:In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05), and those with the same letter superscripts or no letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05),and those with different capital letter superscripts mean extreme difference (P<0.01).The same below.

2.3 MCE对细胞培养液免疫参数和仔猪血清理化指标的影响

由图2(a)可见，60日龄时，三组MCE添加组血清IgG极显著高于对照组(P<0.01)和土霉素组(P<0.01)，C组血清中IgG含量极显著高于B、D组(P<0.01)，E组血清IgG极显著高于对照组(P<0.01)。但是C组极显著高于E组(P<0.01)。由图2(c)可见，C组血清LSZ极显著高于A组和D组(P<0.01)，E组血清LSZ极显著高于A、B、C、D组(P<0.01)，A、B组间差异不显著(P>0.05)。

由图2(b)可见，LPS刺激后，在加入不同浓度MCE提取物之后，细胞培养液中IgG含量极显著高于对照组(P<0.01)，并且极显著高于土霉素组(P<0.01)；土霉素组细胞培养液中IgG高于对照组(P<0.01)。由图2(d)可见，MCE添加组细胞培养液中LSZ极显著高于对照组(P<0.01)；土霉素组与150 ng/mL MCE添加组LSZ含量差异不显著(P>0.05)，但是150 ng/mL MCE添加组与土霉素组LSZ含量显著高于50 ng/mL组及100 ng/mL组(P<0.05)。

图2 断奶仔猪血清IgG(a)与LSZ(c)及细胞培养液IgG(b)与LSZ(d)含量变化情况柱状图Fig.2 The histogram for IgG (a), LSZ(c) content of weaning piglets serum and IgG (b),LSZ (d) content of cell cultures fluid

2.4 MCE对断奶仔猪血清抗氧化参数的影响

日粮中添加MCE后血清T-SOD极显著高于对照组(P<0.01)，且与土霉素组相比差异极显著(P<0.01)；对照组血清T-SOD含量极显著高于土霉素组(P<0.01)。B、C、D组血清MDA含量极显著低于对照组和土霉素组(P<0.01)；MCE添加组间血清MDA含量差异极显著(P<0.01)，C组极显著低于B和D组(P<0.01)；土霉素组MDA含量极显著高于对照组和MCE添加组(P<0.01)。MCE添加组GSH-Px与空白对照组差异不显著，但土霉素组都极显著高于其他四组(P<0.01)。

3 讨 论

3.1 MCE对肠道病原微生物的抑制作用

本试验研究发现，MCE对大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌高度敏感，对沙门氏菌中度敏感；MCE对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为1280、1280、2560、2560 μg/mL。有研究报道，MCE中血根碱在pH为6.5时对变形链球菌、龋齿链球菌、血链球菌、粘性链球菌及内氏放线的最低抑制浓度在4～8 μg/mL之间，并且氢离子浓度影响血根碱的抑菌活性，在抑菌活性方面血根碱与锌具有协同作用[5]。除了抑制细菌之外，MCE对真菌也有不同抑制作用，李静[6]等用MCE制成血根碱酊剂，以维达宁为阳性对照，测定其对4种皮癣真菌抑制效果，结果表明，血根碱酊剂对4种皮癣真菌均具较强的抑制作用，对须癣毛癣菌和许兰黄癣菌的抑制作用尤为明显。Vrublova1[7]用糖酐酯诱导大鼠产生大肠炎，结果表明，含有MCE的饲料添加剂组能减小直肠粘膜损伤，降低直肠髓过氧化物酶活性及环氧化酶2蛋白水平。刘靖[8]研究发现，MCE可以促进黄鸡小肠绒毛形态结构的发育，改善小肠的消化吸收功能。说明MCE可能是通过抑制肠道有害微生物的生长来促进动物机体肠道内健康微生物菌群的形成，降低肠道pH值，从而阻止了病原微生物在肠内的生殖，增加了动物机体对外源性病原菌的抵抗作用。上述报道与本实验结果基本一致，其影响程度与作用机理尚待进一步研究。

表5 MCE对血清 T-SOD，MDA 和GSH-Px含量的影响Table 5 Effect of Macleaya cordata extract on blood T-SOD，MDA and GSH-Px for weaned piglets

3.2 MCE改善断奶仔猪生产性能

本试验研究发现，适宜水平的MCE添加于基础饲料中，对断奶仔猪的生产性能有不同程度的改善。在35～60日龄，基础日粮中添加2.5、5、7.5 mg/kg MCE，对仔猪的平均日增重，平均日采食量及料重比的改善效果明显优于土霉素。这一结果与蔡鹏[9]等报道的，三元仔猪日粮中苯并啡啶类生物碱的添加量0.675 mg/kg(以血根碱+白屈菜红碱总生物碱计)为理想剂量不一致。但是MCE能提高日增重，降低料重比，这一结果与饶华[10]等研究结果一致，结果提示我们，MCE适宜添加量可能与猪品种和日粮组成及有效成分含量有关。其适宜添加水平有待于进一步研究。

3.3 MCE对仔猪血清及细胞培养液免疫应激参数的影响

IgG是动物自然感染和人工主动免疫后机体产生的主要抗体，是动物机体抗感染的主力，在体内发挥抗菌、抗病毒、抗毒素等免疫学活性。本实验中，随日粮MCE添加水平提高，仔猪血清中IgG含量也升高，日粮中添加5 mg/kg MCE与空白对照组相比显著提高了血清中IgG含量(P<0.01)且与土霉素组相比也有显著提高(P<0.01)，说明MCE能显著提高仔猪血清中IgG含量，从而达到提高断奶仔猪自身免疫能力，抵御外界微生物入侵，增强断奶抗病能力。仔猪在断奶时会有断奶应激出现，此时，断奶应激可降低仔猪体循环抗体水平，抑制细胞免疫能力。MCE提高血清IgG则有利于减小断奶应激对仔猪的影响，提高成活率。另外，细胞培养试验中，MCE添加组IgG含量高于对照组和土霉素组(P<0.01)，土霉素组也显著高于对照组(P<0.01)，说明MCE和土霉素均能诱导细胞产生IgG。其作用机制有待于进一步研究。

LSZ有较宽的抑菌谱，对革兰氏阳性细菌有灭杀作用，另外，并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少，结合细菌LPS，减轻内毒素作用，从而增强机体的抵抗力，提高动物的健康水平。在畜禽养殖中，溶菌酶可以提高仔猪生产性能、降低腹泻率，增强免疫力[11]。本试验中，添加5 mg/kg MCE和土霉素组相较于不添加组，血清中LSZ分别提高了20.7%和47.9%，说明MCE和土霉素都能提高机体LSZ活力，增强机体的非特异性免疫能力，但与土霉素相比，MCE为天然植物产物，不存在使用过后耐药性、药物残留等问题，对于解决抗生素使用带来的问题具有积极意义。另外，细胞培养试验中，适宜MCE添加组LSZ含量高于对照组和土霉素组，但差异不显著。

3.4 MCE对仔猪血清抗氧化参数的影响

机体抗氧化防御体系中，T-SOD和GSH-Px对氧化与抗氧化平衡起着至关重要作用。本试验中，添加MCE组仔猪血清中总SOD显著高于对照组和土霉素组(P<0.01)，而血清中GSH-Px含量与对照组持平，却低于土霉素组(P<0.05)，说明GSH-Px可能处于被抑制状态。有研究表明，在机体的抗氧化系统内可能存在着某种动态平衡机制，作为抗氧化系统的SOD和GSH-Px在某种状况下并非同时增加，而是一种机制激活时，另一种可能处于被抑制状态[12]。其作用机理有待于进一步研究。

MDA是脂质过氧化作用的终产物，其含量的高低间接反映机体受氧自由基攻击的严重程度。本试验MCE添加组仔猪血清中MDA极显著低于对照组和土霉素组(P<0.01)，说明MCE提取物能够保护动物机体细胞，降低氧自由基对机体的损害。

4 结 论

MCE对肠道致病菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌都有抑制作用；MCE能显著改善断奶仔猪生产性能，提高血清IgG、T-SOD，降低血清MDA含量，增强仔猪抗病力及抗氧化能力；并能缓解细胞应激的损伤。提示MCE可以替代抗生素应用于仔猪生产。

参考文献：

[1] Pavel Kosina，Jana Gregorova. Phytochemical and antimicrobial characterization of Macleaya cordata herb[J]. Fitoterapia,2010,81(8):1 006-1 012.

[2] 万学攀.博落回生物碱成分分离及抑菌活性研究[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2008.

[3] 何夏阳.血根碱对断奶仔猪生长性能和血液生化指标的影响[D].湖南长沙：湖南农业大学，2010.

[4] 骆 雪.云南特有猪种β-defensin基因表达特点及外源活性物质的调节作用[D].云南昆明：云南农业大学，2012.

[5] 郁建生.博落回制剂对禽霍乱、仔猪白痢的对比治疗试验[J].黑龙江畜牧兽医，2007,2:91-93.

[6] 李 静,范家佑，郁建平,等.血根碱酊剂体外抗真菌初步研究[J].山地农业生物学报,2011,30(4):348-351.

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[8] 刘 靖.博落回生物碱对黄羽肉鸡生长的影响[D].长沙：湖南农业大学，2010.

[9] 蔡鹏,孙志良,曾建国，等.不同剂量博落回提取物对断奶仔猪生长性能的影响[J].中国畜牧兽医，2010,37(5)：41-43.

[10] 饶 华，蔡 鹏，周锡红，等.博落回提取物对断奶仔猪生长性能的影响[J].中国兽药杂志. 2009,43(11)：42-43.

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