五倍子多糖脱蛋白方法的研究

龚力民，刘 伟，张楚晗，李顺祥，张红刚，汤先赤，王文茂

（1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙410208；2.张家界奥威科技有限公司，湖南 张家界427000）

五倍子(Galla chinensis)，性寒，味酸、涩。具有敛肺降火、涩肠止泻等多种功效，临床上主要用于肺热痰嗽、外伤出血、痈肿疮毒等[1]。五倍子由于具有多种药用价值和保健作用，已逐渐深受研究人员的重视，但目前对五倍子的研究大部分都集中于其主要成分单宁酸的分离提取及其化学和药理研究，关于五倍子多糖的研究报道尚不多见。多糖近年来已成为生命科学中最为活跃的研究领域之一，其在降血糖、免疫、抗衰老等方面表现出卓越的生物活性。五倍子粗多糖系从五倍子药材中提取的多糖。用水提取的多糖，常含有一定量的蛋白质。因此，如何尽量多地去除蛋白质而保留多糖成为多糖纯化的一个重要环节。本文对五倍子粗多糖进行除蛋白方法的研究，通过对Sevag 法、蛋白酶法以及两者联用法三种方法的比较，对五倍子粗多糖中蛋白质的去除方法进行了初步探讨。

1 仪器与试药

752N 型紫外可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、T-214 电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）、DZF 真空干燥箱（北京市永光明医疗器械仪器厂）。考马斯亮蓝G-250（AR，天津市光复精细化工研究所）、牛血清白蛋白（99%，Amresco 公司）、木瓜蛋白酶（高纯级，Bomei 公司）、其余试剂均为分析纯；水为蒸馏水。

五倍子由张家界奥威科技有限公司提供，经湖南中医药大学李顺祥教授鉴定为漆树科植物盐肤木Rhus chinensis Mill.叶上的虫瘿。60 ℃烘干，粉碎，过60 目筛，备用。

2 方法与结果

2.1 五倍子多糖的提取

取五倍子粉100 g，加10 倍量蒸馏水，60 ℃超声（20 KHz，600 W）提取2 次，每次20 min，合并水提液，离心，取上清液，浓缩至小体积，加3 倍95%乙醇醇沉，离心取沉淀，60 ℃减压干燥得五倍子粗多糖。

2.2 多糖和蛋白质含量测定方法

2.2.1 样品溶液的配制 取五倍子粗多糖约4.0 g，精密称定，加水溶解并定容至200 mL，摇匀，即得样品溶液（20.00 mg/mL），作为脱蛋白前的准备液。

2.2.2 多糖的测定[1]按《中华人民共和国药典》的硫酸-苯酚法制备A-C 标准曲线，其回归方程为：

A=0.010 06C+0.005，r=0.997 5。

线性范围为10.5～63.0 μg/mL，同时进行样品的测定，计算样品中的多糖含量。

2.2.3 蛋白质的测定[2]按《中华人民共和国药典》的考马斯亮蓝法制备A-C 标准曲线，其回归方程为：

A=0.008 5C+0.019，r=0.998 8。

线性范围为12.5～62.5 μg/mL，同时进行样品的测定，计算样品中的蛋白质含量。

2.3 五倍子多糖除蛋白方法筛选[3]

样品溶液分别采用Sevag 法、蛋白酶法和两者联用法进行除蛋白处理。

2.3.1 Sevag 法 取30 mL 样品溶液3 份，各加入7.5 mL 的三氯甲烷-正丁醇 (4∶1），混匀振荡20 min，离心分去水相与有机相交界处的变性蛋白质，反复5 次。将上层多糖溶液定容至50 mL，测定蛋白去除率和多糖损失率，测定结果见表1。

2.3.2 酶解法 取30 mL 样品溶液3 份，各加入底物2%（12 mg）的木瓜蛋白酶，在60 ℃水浴中酶解反应2 h，90 ℃高温灭酶5 min，离心弃去沉淀，将上清液定容至50 mL。测定蛋白去除率和多糖损失率，见表1。

2.3.3 两者联合法(酶解法+Sevag 法) 取30 mL 样品溶液3 份，各加入底物2%（12 mg） 的木瓜蛋白酶，在60 ℃水浴中酶解反应2 h，反应完后90 ℃高温灭酶5 min，离心，弃去沉淀，上清液再按Sevag法操作，重复5 次，直到无变性蛋白产生为止，将上清液定容至50 mL，测定蛋白质去除率和多糖损失率，见表1。

2.3.4 除蛋白后总固物含量测定 取30 mL 样品溶液3 份，分别照“2.3.1 项”、“2.3.2 项”、“2.3.3 项”方法处理样品，收集所有除蛋白后的溶液，干燥，105 ℃烘干至恒重，精密称重，换算成除蛋白后总固物质量。测定结果见表1。

2.4 三种脱蛋白方法的比较

由表1可知，Sevag 法和联合法脱蛋白的效率最高，酶解法最低。从多糖的损失率来看，Sevag 法损失率最高，酶解法最低。这主要是由于Sevag 试剂（三氯甲烷和正丁醇）与多糖溶液萃取时所形成的凝胶物中会包裹少量多糖物质，容易造成样品的损失，导致多糖损失率较高。木瓜蛋白酶除蛋白，由于酶的降解作用，使得大部分的游离蛋白质和部分结合蛋白质水解，因而联合使用时可以大大减少后续Sevag 试剂的使用次数，多糖损失率也较单用Sevag法时降低。所以本试验确定五倍子粗多糖以蛋白酶+ Sevag 法除蛋白为宜，即先用木瓜蛋白酶降解蛋白质，然后用Sevag 法3 次除去剩下的蛋白质。

表1 三种脱蛋白方法的测定结果

2.5 方法的条件优化

确定五倍子粗多糖除蛋白法为木瓜蛋白酶+Sevag 法后，对此方法进行条件优化。采用单因素试验法，分别考察蛋白酶加入量、酶解pH 以及酶解温度对脱蛋白的影响，以获得最佳酶法脱蛋白条件。如图1。

图1 单因素对脱蛋白的影响折线图

综上所述，用木瓜蛋白酶+ Sevag 联合法脱除五倍子粗多糖的蛋白质的具体条件是：酶用量为底物的2.0%、酶解pH=5、酶解温度50 ℃和反应时间2 h，用此酶解条件和Sevag 法联用，可取得最优的除蛋白效果。验证实验结果蛋白质脱除率为84.5%，多糖损失率为17.9%。

3 讨论

本实验对五倍子多糖脱蛋白方法进行了研究，采用蛋白脱除率和多糖损失率为评价指标，对脱蛋白方法进行了筛选，最后得到了较为理想的蛋白酶+Sevag 联合法：即先用木瓜蛋白酶降解蛋白质，然后用Sevag 法三次除去剩下的蛋白质，最后产品为棕色粉末状。经过脱蛋白处理，粗多糖得到纯化精制，为五倍子多糖的综合利用和后续产品的开发提供了有利条件。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：62，233.

[2]董 洁，郭立玮，文红梅，等.中药水提液中蛋白质含量测定方法研究[J].现代中药研究与实践，2009，22(6)：40-43.

[3]陈占科，王淑美，高 珊，等.制何首乌多糖的脱蛋白研究[J].中国实验方剂学，2011，17(4)：41-43.