蛋白印迹法检测寿胎丸对反复自然流产模型小鼠子宫蜕膜的蛋白表达

雷 磊，李慧芳，谭展望，罗 蕾，卢丽丽

（1.湖南中医药大学分子病理实验室，湖南 长沙410208；2.河北省妇幼保健中心妇女保健科，河北 石家庄050031）

前期通过双相电泳及质谱技术发现并鉴定了30 个可能与复发性流产及寿胎丸干预相关的蛋白质，提示寿胎丸可调节复发性流产小鼠蜕膜组织多种蛋白质的表达[1]。课题组曾探讨寿胎丸对反复自然流产小鼠母胎界面SOCS1 和SOCS3 蛋白表达的影响，结果表明寿胎丸可能通过降低小鼠母胎界面SOCS1 蛋白表达及提高SOCS3 蛋白表达，进而调控Th 细胞向Th2 方向分化，故对反复自然流产有治疗作用[2-3]。本文应用蛋白印迹（western blot）技术对部分差异表达蛋白质的表达水平进行验证。希望通过上述研究，对母胎界面的病理生理提供更为全面和有价值的信息，进而从分子水平探讨寿胎丸安胎的作用机制，为中医药防治复发性流产提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

健康雌性CBA/J 小鼠50 只，SPF 级，8 周龄，体质量（19.7±2.3）g，由中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK（京）2009-0004；健康雄性DBA/2 小鼠20 只，SPF 级，8 周龄，体质量 （24.7±2.5）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2007-0005；健康雄性BALB/C小鼠5 只，SPF 级，8 周龄，体质量（23.2±1.8）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2009-0004。

1.2 实验药物

寿胎丸由菟丝子、续断、桑寄生和阿胶4 味中药饮片按2∶1∶1∶1 比例组成，将前3 味药混和，置圆底烧瓶中，加10 倍量水，加热回流提取2 h，提取液滤过，残渣加10 倍量水继续加热回流提取2 h，提取液滤过，合并2 次滤液，阿胶烊化于滤液中，浓缩至含生药量1 g/mL，4 ℃保存备用。

1.3 主要仪器

BMJ-1 生物组织包埋机（天津航空机电公司）；Shandon325 石蜡切片机 （英国Shandon 公司）；LEICA DM LB2 双目显微镜（德国LEICA 公司）；Motic B5 显微摄像系统 （麦克奥迪实业集团公司）；MIAS医学图像分析系统（北航公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf 公司）；紫外分光光度计 （美国Beckmen 公司）；垂直电泳槽、转移电泳槽及电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；图像扫描仪（美国Bio-Rad 公司）；Kodak Digital Science ID 图像分析系统 （美国Kodak 公司）。

1.4 主要试剂

兔抗鼠热休克蛋白27（HSP27）抗体、兔抗鼠α烯醇化酶（α-enolase）抗体、兔抗鼠转铁蛋白（Transferrin）抗体、兔抗鼠膜联蛋白A2（Annexin A2）抗体、兔抗鼠β-actin 抗体、PVDF 膜、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗、DAB 显色试剂盒、ECL 发光试剂盒均购自美国Bethyl 公司。

2 方法

2.1 动物造模方法[4]

将50 只雌性CBA／J 小鼠分别与20 只雄性DBA／2 和5 只BALB／c 小鼠按2∶1 合笼交配，检到阴栓者计为妊娠第0 d，分别建立反复自然流产模型40 只与正常妊娠模型10 只。

2.2 动物分组及给药方法

CBA／J×BALB／c 孕鼠作为正常妊娠组（10 只），CBA／J×DBA／2 孕鼠作为反复自然流产模型（40只），按妊娠顺序随机分为模型组、寿胎丸低、中、高剂量组，每组10 只。寿胎丸剂量根据成人70 kg 临床用量按动物体表面积换算，灌胃容积均为0.4 mL／20 g。其中寿胎丸低剂量组为临床等效剂量，低、中、高剂量组给药剂量分别为含生药量3、6、12 g／kg。正常妊娠组和模型对照组给予相同体积蒸馏水，连续灌胃给药14 d。

2.3 标本制备方法

孕14 d 断颈处死小鼠，妊娠子宫离体后，自子宫角处钝性撕开子宫壁，将胎儿胎盘单位从着床部位剥离，用小号组织剪刀分离着床部位的蜕膜组织，取5 个着床部位，用预冷的PBS 冲洗干净后，迅速置液氮中保存。

2.4 western blot 分析方法

将蜕膜组织从液氮中取出，加入适量蛋白裂解液（按50 mg 标本用1 mL 裂解缓冲液），冰浴裂解1 h，12 000 r/min，4 ℃离心45 min，取上清即为蜕膜组织总蛋白。蛋白质浓度测定采用Amersham Biosciences 公司专门针对蛋白质组学研究的蛋白质抽提设计的2D Quant Kit 定量试剂盒。50 μg 总蛋白上样进行SDS-PAGE 电泳，分离后的蛋白10 V恒压25 min 转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入1∶200 稀释的HSP27 一抗4 ℃孵育过夜，再置于1∶1 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液中室温孵育2 h，洗膜后加入ECL发光液显色曝光。同时以β-actin 作为上样量的内参照，将所得X 光片扫描，记录下来的照片通过计算机图像分析系统，计算各实验组指标与β-actin的光密度比值，作为HSP27、α-enolase、Transferrin、Annexin A2 的相对表达量。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 小鼠蜕膜组织HSP27 表达水平比较

以β-actin 蛋白作为内参，计算HSP27/β-actin比值并进行统计分析，结果显示，小鼠模型组与正常组相比，蜕膜HSP27 表达明显升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；寿胎丸高、中、低剂量组与模型组相比，蜕膜HSP27 表达均降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；寿胎丸高剂量组蜕膜HSP27 表达较中、低剂量组明显降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。见表1和图1。

表1 小鼠蜕膜HSP27 表达水平比较 （±s，n=10）

表1 小鼠蜕膜HSP27 表达水平比较 （±s，n=10）

注：与模型组比较**P＜0.01；与寿胎丸高剂量组比较☆☆P＜0.01。

组 别模型组正常组寿胎丸高剂量组寿胎丸中剂量组寿胎丸低剂量组剂量（g/kg）——1 263 HSP27/β-actin 0.663 0±0.001 3 0.214 4±0.001 2**0.203 8±0.001 7**0.287 8±0.001 6**☆☆0.297 8±0.001 2**☆☆

图1 HSP27 在各组细胞质内的表达电泳图

3.2 小鼠蜕膜组织α-enolase 表达水平比较

以β-actin 蛋白作为内参，计算α-enolase/βactin 比值并进行统计分析，结果显示，小鼠模型组与正常组相比，蜕膜α-enolase 表达明显升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；寿胎丸高、中、低剂量组与模型组相比，蜕膜α-enolase 表达均降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；寿胎丸高剂量组蜕膜α-enolase 表达与中、低剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2和图2。

3.3 小鼠蜕膜组织Transferrin 表达水平比较

以β-actin 蛋白作为内参，计算Transferrin/βactin 比值并进行统计分析，结果显示：小鼠模型组与正常组相比，蜕膜Transferrin 表达明显降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；寿胎丸高剂量组与模型组相比，蜕膜Transferrin 表达升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；寿胎丸中、低剂量组与模型组相比，蜕膜Transferrin 表达差异无统计学意义 （P＞0.05）。见表3和图3。

表2 小鼠蜕膜α-enolase 表达水平比较 （±s，n=10）

表2 小鼠蜕膜α-enolase 表达水平比较 （±s，n=10）

注：与模型组比较**P＜0.01。

组 别模型组正常组寿胎丸高剂量组寿胎丸中剂量组寿胎丸低剂量组剂量（g/kg）——1 263 α-enolase/β-actin 0.421 9±0.001 1 0.330 9±0.001 1**0.311 9±0.001 3**0.311 1±0.001 4**0.311 5±0.001 5**

图2 各组中α-enolase 的表达电泳图

表3 小鼠蜕膜Transferrin 表达水平比较 （±s，n=10）

表3 小鼠蜕膜Transferrin 表达水平比较 （±s，n=10）

注：与模型组比较**P＜0.01；与寿胎丸高剂量组比较☆☆P＜0.01。

组 别模型组正常组寿胎丸高剂量组寿胎丸中剂量组寿胎丸低剂量组剂量（g/kg）——1 263 Transferrin/β-actin 0.2611±0.0012 0.4912±0.0011**0.4501±0.0012**0.2626±0.0015☆☆0.2632±0.0016☆☆

图3 各组中Transferrin 的表达电泳图

3.4 小鼠蜕膜组织Annexin A2 表达水平比较

以β-actin 蛋白作为内参，计算Annexin A2/βactin 比值并进行统计分析，结果显示，小鼠模型组与正常组相比，蜕膜Annexin A2 表达明显降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；寿胎丸高、中、低剂量组与模型组相比，蜕膜Annexin A2 表达均升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；寿胎丸高剂量组蜕膜Annexin A2 表达较中、低剂量组明显升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。见表4和图4。

表4 小鼠蜕膜Annexin A2 表达水平比较 （±s，n=10）

表4 小鼠蜕膜Annexin A2 表达水平比较 （±s，n=10）

注：与模型组比较**P＜0.01；与寿胎丸高剂量组比较☆☆P＜0.01。

组 别模型组正常组寿胎丸高剂量组寿胎丸中剂量组寿胎丸低剂量组剂量（g/kg）——1 263 Annexin A2/β-actin 0.333 4±0.001 3 0.549 8±0.001 1**0.536 5±0.001 3**0.462 0±0.001 2**☆☆0.462 6±0.001 2**☆☆

图4 各组中Annexin A2 表达的影响电泳图

4 讨论

Western blot 技术是一种利用抗原-抗体反应的特异性，快速、灵敏地检测和鉴定蛋白质的技术，它将蛋白质的电泳分离和免疫学鉴定结合在一起，该技术有效克服了免疫沉淀技术中的某些不足 （如抗原须用同位素标记、紧密相关大分子的共沉淀、抗原的溶解度等)，非常实用而被广泛接受。用SDS、尿素或还原剂(2-巯基乙醇等)增溶抗原混合物后，进行SDS-PAGE，然后将被分离的蛋白质电转移至硝酸纤维素薄膜，并与之不可逆地结合。随后封闭薄膜上非特异性的抗体结合位点，再与靶抗体特异性结合，最终与HRPO-Ig 偶联物保温，从颜色反应的深度探测膜上印迹蛋白抗原的存在与含量[5]。

前期研究建立了模型组、正常组、寿胎丸高、中、低剂量组小鼠蜕膜组织的2-DE 图谱，通过比较各组双向凝胶电泳图谱的差异，发现并鉴定了30 个可能与复发性流产及寿胎丸干预相关的蛋白质，这些蛋白质的功能涉及绒毛外滋养细胞的侵袭、蜕膜组织血管的重建及蜕膜细胞的凋亡等[1]。由于在实验过程中，可能会出现假阳性的实验结果，故采用Western-blot 从蛋白质水平进行验证，验证得到的阳性结果才是真正的差异表达蛋白质[6]。

Hsp27 是小分子热休克蛋白，与妊娠的关系逐渐受到重视，其与滋养细胞迁移、胎儿发育、分娩发动、子痫前期发病密切相关[7]。Hsp27 可能通过直接影响细胞骨架蛋白结构或通过影响MMP-2 活性，而干扰滋养细胞迁移，影响胎盘形成[8]。Hsp27 是P29 雌激素受体连接蛋白，可与雌激素受体相互作用，影响胎儿发育[9]。α 烯醇化酶（α-enolase）普遍存在于生物体内。在糖酵解过程中，它催化a 磷酸甘油形成磷酸烯醇式丙酮酸。主要参与过敏性反应、低氧耐受性、控制生长等多种细胞生理过程，并且还是几种细胞表面纤溶酶的受体和激活物[10]。转铁蛋白（Transferrin）-转铁蛋白受体（Transferrin R）途径是哺乳动物组织细胞生理条件下主要的摄铁途径，同样在胎盘铁转运中也起关键作用。胎盘合体滋养层细胞母体侧（顶膜）主要表达Transferrin R1，母体血液中Fe3+-Transferrin 与STB 顶膜上TransferrinR1 结合成Transferrin-TransferrinR 复合物被内吞，在内吞小体酸性环境下，Fe3+从Tf 中释放，脱铁Transferrin 和TransferrinR 被运回胞外可继续利用[11]。膜联蛋白A2（Annexin A2） 是钙离子依赖的磷脂结合蛋白Annexins 家族的重要成员之一，研究显示，子疒间前期患者Annexin A2 表达水平下调，可能会增加凝血酶的合成，进而促进妊娠期高凝状态的形成，从而在子疒间前期的发生、发展中发挥作用。此外，来自栓塞性脑卒中大鼠模型的证据表明静脉注射重组Annexin A2 能明显抑制体内血栓的形成[12]。

本研究采用Western blot 法检测了模型组、正常组、寿胎丸高、中、低组小鼠蜕膜组织的HSP27、α-enolase、Transferrin、Annexin A2，结果与蛋白质组学分析结果一致，从一定程度上证明了蛋白质组学实验方法的稳定性及其结果的准确性；寿胎丸通过下调复发性流产小鼠蜕膜组织HSP27、α-enolase 蛋白的表达，缓解氧化应激反应，改善蜕膜组织的缺氧状态，逆转细胞内ATP 的产生途径，同时上调Transferrin、Annexin A2 蛋白的表达，提高摄取母血铁能力，改善蜕膜组织的高凝状态，预防血栓形成，保持血流通畅，从而实现维持妊娠，降低胚胎丢失率，这可能是其安胎的作用机制之一。

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