活血、破血药对动脉粥样硬化大鼠PCNA蛋白、VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA表达的影响

谢海波，罗尧岳，莫新民，吴亦之，卢 青，徐豫湘，李 武

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410007）

动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病的主要病理基础之一，是一种常见病、多发病。根据AS 的表现，中医可将其归为“血瘀”、“瘕结”等范畴，常采用活血化瘀药治疗。活血化瘀药有活血止痛、活血调经、活血疗伤、破血消癥之分[1]。总的来说，根据活血化瘀程度不同，可分为活血和破血两类。本研究选用活血药当归、川芎和破血药三棱、莪术，观察两类药对AS 大鼠主动脉内膜增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白及血管内皮生长因子（VEGF）VEGFmRNA、血管内皮生长因子受体 （VEGFR）VEGFR-2mRNA 表达的影响，探讨二者的作用差异，为临床处方选药提供实验依据。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性Wistar 大鼠，8 周龄，体质量（200±10）g，60 只。由湖南中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCxk 豫2005-001。

1.1.2 药物 当归、川芎和三棱、莪术均购于湖南中医药大学第一附属医院，常规煎煮，制成含生药0.18 g/mL 的药液，5 ℃保存备用。

1.1.3 试剂 胆固醇由中国医药（集团）上海化学试剂公司提供（批号：20080923）；胆酸钠由上海蓝季科技发展有限公司提供（批号:080628）；维生素D3注射液由苏州第六制药厂生产（批号:070621）；丙基硫氧嘧啶由南通精华制药股份有限公司生产 （批号:080701）；阿托伐他汀（立普妥）由大连辉瑞制药有限公司分装 （批号:85837034）；猪油购自农贸市场。PCNA 免疫组化染色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供 （编号：BM0104）；VEGF 原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供 （编号：MK1142）；VEGFR-2 原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供（编号：MK1145）。

1.1.4 仪器 JY3002 型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；HHS-2 电子恒温不锈钢水浴锅：上海南阳仪器有限公司；LEICA DM LB2 型双目显微镜：德国LEICA 公司；Shandon325 型石蜡切片机：英国Shandon 公司；7170A日立全自动生化分析仪：日本日立公司；TDZ4-WS 低速台式离心机：上海华岩仪器设备有限公司；MIAS 医学图像分析系统：北航公司；Haier 医用微波炉：Haier 集团；DNP-9162 型电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；S2-93 自动双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 动物适应性饲养1 周后按随机数字表法将60 只大鼠分为5 组，即空白组、模型组、活血药（当归、川芎）组、破血药（三棱、莪术）组、他汀组，每组12 只。

1.2.2 造模方法 空白组每日给予普通饲料，其它各组大鼠首先腹腔注射维生素D3(70 万IU／kg，分3 次，每2 d 注射1 次)，然后各组每日每只给予高脂饲料（2%胆固醇，0.5%胆酸纳，3%猪油，0.2%丙基硫氧嘧啶和94.3%的基础饲料）20 g，连续喂饲12 周[2-3]。随机抽取2 只大鼠，处死后速取主动脉，浸入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，石蜡包埋切片，HE 染色，光学显微镜下观察发现已形成粥样硬化斑块，证实造模成功。

1.2.3 给药剂量及方法 造模成功后，按成人体质量70 kg 等剂量计算大鼠用药剂量，灌胃给药，每天1 次，灌胃体积10 mL/kg，空白组、模型组灌服等体积白开水；活血药组灌服当归、川芎煎液，给药体积10 mL/(kg·d)，给药剂量为1.8 g/（kg·d）；破血药组灌服三棱、莪术煎液[给药体积10 mL/(kg·d)，给药剂量1.8 g/（kg·d）]；他汀组灌服阿托伐他汀给药体积10 mL/(kg·d)，给药剂量0.001 8 g/kg，各组给药剂量均一，连续用药4 周。

1.2.4 指标检测 （1）主动脉内膜PCNA 蛋白表达的检测 采用免疫组化染色法，具体操作方法按试剂盒说明书进行。（2） 主动脉内膜VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 表达的检测 采用原位杂交法检测，操作步骤按试剂盒说明书进行。（3） 结果判断①PCNA 以细胞核呈棕黄色颗粒为阳性。每张切片在40 倍物镜下随机选取4 个视野，用图像分析软件测定阳性细胞数。②VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA以细胞膜或胞浆着色呈棕黄色为阳性。每张切片在40 倍物镜下随机选取4 个视野，用图像分析软件测定VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 阳性表达强度的平均灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组主动脉内膜PCNA 表达的比较

免疫组化染色结果显示：空白组可见PCNA 阳性表达，模型组、他汀组、活血组和破血组PCNA 阳性细胞表达增多。

模型组PCNA 阳性细胞数高于空白组、他汀组、活血组和破血组（P＜0.05）；破血组PCNA 阳性细胞数低于活血组（P＜0.05），二者组间比较有统计学意义。见表1。

表1 各组主动脉PCNA 表达的阳性细胞数 （n＝10，±s）

表1 各组主动脉PCNA 表达的阳性细胞数 （n＝10，±s）

注：与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与活血组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组 别空白组模型组他汀组活血组破血组给药剂量（g/kg）— —0.001 8 1.80 1.80阳性细胞数58.9±7.26△△**93.7±9.93*79.7±7.18△81.2±7.21△68.8±8.39△△*

2.2 各组VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 表达的比较

原位杂交结果显示：空白组可见VEGFmRNA及VEGFR-2mRNA 阳性表达，模型组、他汀组、活血组和破血组VEGFmRNA 及VEGFR-2mRNA 阳性表达信号增多。

模型组VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 平均灰度值均高于空白组、他汀组、活血和破血组（P＜0.05）；活血组、破血组组间比较无统计学意义。见表2。

表2 各组VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA平均灰度值比较 （n＝10，±s）

表2 各组VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA平均灰度值比较 （n＝10，±s）

注：与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与活血组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组 别空白组模型组他汀组活血组破血组给药剂量（g/kg）——0.001 8 1.80 1.80 VEGFmRNA 70.5±8.77△△**111.4±13.34*82.7±12.16△△90.5±10.74△83.4±10.33△△VEGFR-2mRNA 62.1±8.65△△103.5±12.66**76.1±13.75△△82.9±15.47△75.1±11.69△△

3 讨论

血管内皮细胞（VEC）的增殖可以促进血管形成[4]。生理性血管形成对血管的生成、成长和修复至关重要；病理性血管形成是AS 一个重要特征[5]。最近越来越多的证据表明，VEGF 与AS 的进展和斑块不稳定性有密切关系，可通过炎症浸润和新生血管形成等机制促进粥样硬化损伤的进展。

VEGF 是目前已知的功能最强的促有丝分裂素，特异的作用于VEC，诱导VEC 的增生、迁移，在生理性和病理性血管形成过程中发挥着重要作用。VEGFR 介导了一系列细胞行为包括细胞迁移、存活、增殖等。VEGFR-2 主要功能是在各种生理病理情况下介导新生血管的形成。近来的研究表明，VEGF／VEGFR-2 促进VEC 增殖和存活的作用还需要细胞表面黏附蛋白的参与[6]。PCNA 即细胞增殖核抗原，是一种在增殖细胞中合成或表达的核抗原，相对分子质量约为36×103，是真核细胞DNA 聚合酶δ 的辅助因子，与DNA 合成和细胞增殖相关[7]。

黄正华等[8]研究川芎嗪对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖的影响，结果发现：川芎嗪对条件培养基诱导的HUVEC 增殖有明显抑制作用，增殖抑制率随着药物浓度的增加和作用时间的延长而升高。刘凯[9]观察当归红芪合剂超滤膜提取物对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)VEGFmRNA 表达的影响，结果发现当归红芪合剂超滤膜提取物对ECV-304 细胞有促增殖的作用，其机制是通过诱导ECV-304 细胞VEGFmRNA 表达实现的。叶兰等[10]研究提示三棱、莪术含药血清可抑制VEGF 诱导的血管内皮细胞增殖，其机制与抑制VEGF 表达密切相关。目前研究多局限于某一种或几种活血化瘀药或有效成分对VEC 增殖的调节作用，而未见有将活血药、破血药对VEC 增殖的调节作用进行比较研究的报道。

我们前期研究表明[11]：活血药（当归、川芎）、破血药（三棱、莪术）均能降低AS 大鼠血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC），且在降低LDL-C 的幅度上破血药（三棱、莪术）大于活血药（当归、川芎），但二者间无统计学意义，提示两者均有抗AS 作用。本实验从VEC 增殖角度出发，选择PCNA 蛋白、VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 作为观察指标，探讨活血药（当归、川芎）、破血药（三棱、莪术）抗AS 的作用机制及差异。实验结果初步表明：活血药（当归、川芎）、破血药（三棱、莪术）均能 抑 制PCNA、VEGFmRNA、VEGFR-2mRNA 的 表达，在抑制PCNA 表达方面，破血药三棱、莪术优于活血药当归、川芎。此结果表明二者均有抑制VEC增殖作用，但在作用环节和靶点上有一些差异，这种差异能否说明破血药（三棱、莪术）在抑制VEC 增殖上优于活血药（当归、川芎）仍有待进一步研究。

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