血栓前状态分子与冠心病血瘀证的相关性研究

王 萍，黄献平，王丽萍，喻松仁，孙安会，袁肇凯

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.江西中医学院，江西 南昌330000）

血栓前状态(Prethrombotic state，PTS)，既往称血液高凝状态，是在血管内皮细胞及凝血、抗凝、纤溶系统以及血流动力学等多种因素改变的综合作用下发生的一种病理过程。现代医学认为冠心病具有一定的遗传性，且普遍存在着血栓前状态，而血瘀证作为中医证候概念下许多疾病的一种血液运行不畅的病理阶段，被认为与PTS 有着密切的关系。血瘀证是冠心病有规律的一种病理表型，其血栓前状态分子是否存在着一定遗传性值得探讨，本研究以具有遗传特征的家系人群为对象，探讨PTS 分子与冠心病血瘀证的关系，同时对冠心病血瘀证非家系人群进行同步对照研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象

冠心病血瘀证患者来源于2010年1月～2011年l月湖南中医药大学第一附属医院、湖南省中医药研究院附属医院心内科住院病人以及在长沙砂子塘社区、梨子山社区、长沙冶金研究设计院等单位进行冠心病血瘀证遗传流行病学调查中符合诊断标准和纳入标准的冠心病人。“冠心病” 诊断参照1979年国际心脏病学会/美国心脏协会及WHO 冠心病诊断标准，须排除疾病的诊断均按相关的国际诊断标准进行。冠心病“血瘀证”的诊断参照《中华人民共和国中医药行业标准·中医病症诊断疗效标准》及国家中药管理局医政司胸痹急症组和中国中医药学会心病专业委员会《中医心病诊断疗效标准与用药规范》进行。“冠心病血瘀证家系”定义为先证者的一级亲属(包括父母、同胞及子女)中至少有1 人为冠心病血瘀证患者。

本研究纳入对象基本情况如下：A 组：家系冠心病血瘀证组，24 例，其中男14 例，女性10 例，平均年龄（65.38±9.64）岁；B 组：家系冠心病非血瘀证组，9 例，其中男1 例，女性8 例，平均年龄（69.89±8.07）岁；C 组：家系非冠心病血瘀证组，14 例，其中男5例，女性9 例，平均年龄（62.43±8.27）岁；D 组：家系健康人组，10 例，其中男4 例，女性6 例，平均年龄（43.70±20.54）岁；E 组：非家系冠心病血瘀证组，21例，其中男6 例，女性15 例，平均年龄（69.24±6.40）岁；F 组：非家系健康人对照组，7 例，其中男3 例，女性4 例，平均年龄（55.29±11.16）岁。IBM SPSS statistics 19.0 软件对各组间性别构成和平均年龄进行分析，结果差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 研究方法

纳入对象均于清晨空腹静脉取血，分离血浆或血清，按各血栓前状态分子标记物检测要求进行测定。其指标如下 （1）血管内皮细胞损伤分子标记物：血浆血栓调节蛋白（TM）；（2）血小板活化分子标记物：血小板表面P-选择素（P-Selectin）；（3）凝血系统激活及微量纤维蛋白形成分子标记物：凝血酶原片段1、2（F1+2）、可溶性纤维蛋白单体（SFMC）；（4） 纤溶系统分子标记物：组织型纤溶酶原激活物（tPA）、纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）；（5）抗凝系统分子标记物：凝血酶-抗凝血酶III 复合物（TAT）。

各血栓前状态分子标记物的检测均按照ELISA试剂盒说明书进行。酶标仪450 nm 波长检测各孔的吸光度 （OD 值）。测定在加终止液15 min 内进行。

2 结果

2.1 标准品曲线拟合

各指标检测出标准品OD 值，根据OD 值与已知标准品浓度进行曲线拟合，此处采用MasterPlex 2010 软件进行二次多项式（y=a+bx+cx^2）拟合。

2.2 PTS 分子标记物的计算

运用上述标准曲线，计算出各组相应的分子标记物值。由于实验误差所致，各组值通过IBM SPSS statistics 19.0 进行分析，剔除离群值和极端值进行分析。各组的PTS 分子标记物的平均浓度如表1。

表1 各组PTS 分子标记物的平均测定浓度 （±s）

表1 各组PTS 分子标记物的平均测定浓度 （±s）

组 别 n TM (μg/L) n P-Seletin (pg/mL) n F1+2 (nmol/L) n SFMC (μg/mL) n t-PA (μg/L) n PAI-1 (ng/L) n TAT (pmol/mL) A 23 19.33±5.97 22 367.41±93.99 24 895.75±449.44 23 45.83±17.66 23 12.17±3.57 23 705.37±224.44 24 27.87±8.55 B 7 14.08±1.88 8 287.32±41.34 8 668.78±222.46 8 29.63±2.12 8 9.30±1.08 8 559.98±75.82 7 18.58±2.07 C 11 15.08±1.36 12 326.41±72.82 11 615.32±84.75 12 36.25±12.12 11 9.16±0.68 9 488.75±37.84 12 20.05±5.75 D 9 13.78±1.57 9 294.77±21.09 9 535.22±106.25 9 32.61±6.28 9 9.50±0.54 9 550.25±70.58 9 19.95±2.03 E 17 13.95±1.44 18 306.24±34.28 18 503.80±115.32 18 32.68±4.28 19 9.00±0.77 20 523.65±120.89 20 19.16±4.18 F 7 26.00±15.01 7 519.70±298.09 6 803.56±437.01 6 48.44±21.73 6 12.84±4.85 5 625.10±232.74 7 29.83±14.65

2.3 PTS 分子标记物的统计分析

各组结果采用IBM SPSS statistics 19.0 进行分析，由于各组间方差齐性分析P＜0.05，方差不齐，故采用oneway annova (Tamhane)进行各组间的均数比较。结果如下：

2.3.1 家系冠心病血瘀证与家系各组间比较。TM:冠心病血瘀证与冠心病非血瘀证、非冠心病血瘀证和健康人比较均有统计学差异 （P 值分别为0.016，0.048，0.005），TM 的含量较后三者高。P-Selectin：冠心病血瘀证与冠心病非血瘀证和健康人比较有统计学差异 （P 值分别为0.048，0.031），P-Selectin 含量较后二者高，与非冠心病血瘀证比较无统计学差异（P=0.938）。F1+2：冠心病血瘀证与健康人比较有统计学差异（P=0.015），F1+2 含量较后者高，与冠心病非血瘀证和非冠心病血瘀证无统计学差异（P=0.674，0.096）。SFMC：冠心病血瘀证与冠心病非血瘀证有统计学差异 （P=0.004），SFMC 含量较后者高，与非冠心病血瘀证和健康人比无统计学差异（P=0.657，0.058）。t-PA：冠心病血瘀证与冠心病非血瘀证、非冠心病血瘀证及健康人比较均有统计学差异 （P=0.028，0.010，0.028），t-PA 含量较 后 三者高。PAI-1：冠心病血瘀证与非冠心病血瘀证有统计学差异（P=0.002），含量较后者高，与冠心病非血瘀证和健康人比较无统计学差异 （P=0.160，0.086）。TAT：冠心病血瘀证与冠心病非血瘀证、非冠心病血瘀证及健康人比较均有统计学差异 （P =0.001，0.042，0.003），含量较后三者高。

2.3.2 非家系两组间的比较。冠心病血瘀证各血栓前状态分子与健康人比较均无统计学差异 （TM：P=0.705，P-Selectin：P=0.817，F1+2：P=0.920，SFMC：P=0.889，t -PA：P =0.828，PAI -1：P =0.999，TAT：P =0.806）。

3 讨论

TM 是一种普遍存在于细胞膜表面具有较强抗凝活性的跨膜糖蛋白。有研究表明TM 的下降与血瘀证存在着线性关系[1]，本研究结果表明家系冠心病血瘀证的TM 水平较家系健康人高，也高于家系冠心病非血瘀证和家系非冠心病血瘀证，与其他研究结果不一致。而t-PA 和PAI-1 是纤溶系统的主要成分，是纤溶系统关键性调节物质，二者之间的动态平衡对维持正常的血液流动具有重要意义。研究发现[2-3]，冠心病患者的血浆t-PA 活性减低，PAI-1 活性增高，但本研究结果表明家系冠心病血瘀证的PAI-1 水平与家系健康人比较无明显差异，而t-PA 水平高于家系健康人，也与其他研究结果不一致。凝血酶原片段1+2（F1+2）是在血液凝固过程中因子Xa 复合物水解凝血酶原后所生成的多肽片段。检测F1+2 在血浆中的水平，可较灵敏地反映Ⅹa 的活性及凝血状态，在冠心病患者的研究中也较健康人水平增加[4]。P-选择素(P-Selectin)介导血小板黏附于内皮细胞，激活中性粒细胞，释放血管活性物质和氧代谢产物，导致血管收缩，阻塞小血管从而启动血栓形成过程，其在CHD 的发生发展中起着重要作用[5-6]。TAT 是凝血酶被抗凝血酶III 中和后形成的，能使凝血酶被灭活，是反映凝血酶生成和活性增高的敏感分子标志物，在冠心病中较健康人水平增加[7]。本研究结果表明家系冠心病血瘀证患者P-Selectin、F1+2、TAT的血浆水平较健康人组高，与其他研究结果相同。

家系人群研究中冠心病血瘀证患者与健康人比较能抑制凝血的分子TM、t-PA 水平增加，促进凝血的P-Selectin、F1+2、TAT 等分子水平也增加。为何这两种相互拮抗的分子同时增加，是后续研究需要探讨的问题。这种现象在冠心病血瘀证与冠心病非血瘀证比较中也有体现。

在非家系的人群研究中冠心病血瘀证与健康人比较，各种PTS 分子的水平均无明显差别。从数据分析可知，非家系人群的PTS 分子水平在个体间差异较大，这是否是由于研究设计或检测方法的缺陷所致，还是说明PTS 分子在家系人群中具有较为稳定的遗传表现特征，也是值得继续研究的方向。

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