银翘散对兔内毒素血症IL-6、TNF-α早期干预的影响

肖碧跃，赵国荣，贺又舜，艾碧琛，何宜荣，曾序求，陈锡军，谢 静

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

内毒素血症即血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的液体而引起的一种病理生理表现。可以出现在多系统的多种疾病中，通常导致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等，病死率极高。而作为辛凉解表法之代表方银翘散，是中医临床上广泛使用并且疗效确切的中药方剂之一。本实验通过观察银翘散对内毒素血症兔早期白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）释放的影响，探讨银翘散治疗感染性疾病的作用机制，为银翘散的临床运用提供客观的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 新西兰大耳白兔，18 只，雌雄各半，体质量（2±0.5）kg，购自湖南长沙市岳麓区东创实验动物科技服务部[许可证号：SCXK（湘）2009-0012]。购后置于湖南中医药大学实验中心动物房饲养。动物于实验前单笼饲养适应环境3 d，室温控制在24～27 ℃，相对湿度65%～70%，自由饮食和摄水。

1.1.2 药物与试剂 银翘散药物剂量按《温病条辨》原方比例配制（连翘15 g，金银花5 g，桔梗6 g，薄荷6 g，竹叶4 g，生甘草5 g，荆芥穗4 g，淡豆豉5 g，牛蒡子6 g），由湖南中医药大学第一附属医院提供。所有饮片用粉碎机粉碎，放入煎药机内，加水适量，浸泡0.5 h，水煎煮，浓缩至浓度为1 g/mL（生药）的药液冷藏备用。大肠杆菌内毒素(Esch erichia coil O111∶B4) 购自美国SIGMA-ALDRICH 公司，批号：011M4008V。用无菌生理盐水将内毒素配制成浓度为10 μg/mL 溶液，造模剂量为每只家兔10 μg/kg，经耳缘静脉注射。20%乌拉坦溶液（由湖南中医药大学组胚实验室提供）：称取20.00 g 乌拉坦溶解于100 mL 生理盐水中得20%乌拉坦溶液，每只兔子按3 mL/kg 经耳缘静脉缓慢注射。TNF-α试剂盒 （编号：DZE400750，RND 分装）IL-6 试剂盒（编号：DZE40017，RND 分装）。

1.1.3 仪器 酶标仪 （型号：MK3 生产厂家：芬兰LABSYSTBA 集团）；多管架自动平衡离心机（型号：TDZ5-4.0 厂家：长沙天创仪器制造有限公司）；电热恒温水温箱（型号：HH·W21·Cu600），电热恒温干燥箱（型号：202-2AB 厂家：北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 方法

分组、造模与给药 将18 只兔子按雌雄先分为两组，再按随机数字表法，分为3 组，即空白组、模型组、银翘散组，每组6 只。家兔正常饲养3 d 后，每天测量肛温3 d，取平均值为基础体温，并记录各组家兔的一般情况。模型组、银翘组注射内毒素，按1 mL/kg 体质量经耳缘静脉注射进行造模[1]，空白组按10 mL/kg 体质量注入无菌生理盐水作为对照。记录各组家兔症状、体征，每0.5 h 测量体温1 次（体温升高0.3 度为发热），并记录开始发热时间（经预实验观察一般开始发热时间为造模后20 min），在发热后进行灌胃。空白组及模型组按10 mL/kg 蒸馏水，银翘散组则灌入10 mL/kg 银翘散药液。灌胃后每0.5 h 测量体温1 次，观察各组兔全身状态。

1.3 检测指标

1.3.1 一般情况 观察实验动物的精神状态、饮水、食欲、耳廓及眼结膜充血、毛发等情况。

1.3.2 血清中IL-6、TNF-α 的含量表达 银翘散灌胃后2 h 各组进行心脏采血，3 000 r/min，离心10 min 后取上清液，-70 ℃冰箱冻存，采用酶联免疫吸附法集中成批检测。检测步骤、方法严格按试剂盒说明书进行。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况观察

造模后0.5 h，模型组及银翘组动物体温开始上升，耳廓及眼结膜充血，懒动，饮水稍有增加，银翘散组在灌胃后0.5 h 体温继续上升，1 h 后开始下降，2 h 基本恢复正常，耳廓及眼结膜充血，饮水情况好转，并恢复自由活动。而模型组各动物灌胃后1 h体温一直上升，1～2 h 体温维持稳定，其他一般情况未见明显好转。

2.2 银翘散对IL-6、TNF-α 表达的影响

实验结果显示，银翘组IL-6、TNF-α 的表达明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01），其表达接近空白组（P＞0.05）。见表1。

表1 银翘散对各组兔血清IL-6、TNF-α表达水平的比较 （pg/mL，±s）

表1 银翘散对各组兔血清IL-6、TNF-α表达水平的比较 （pg/mL，±s）

注：与模型组比较▲P＜0.01；与空白组比较◆P＞0.05。

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3 讨论

中医温病学认为卫分证属温邪袭表，肺卫失宣，为疾病的最初阶段，病程短，病情轻，治疗上只要因势利导，引邪外出，宣发肺卫，使卫主温煦、主防御、司开合功能正常，卫分证则能得以治愈。强调卫分证不能过用苦寒清热，以免引邪深入。银翘散是我国清代著名温病学家吴瑭创制的方剂。《温病条辨》称本方为“辛凉平剂”，具有辛凉解表、清热解毒的功效，主治风温初起，当时以治疗风温、温热病以及某些杂病属于邪在卫分、上焦而闻名，并一直沿用至今。《温病条辨》记载银翘散为“风淫于内，治以辛凉，佐以苦甘；热淫于内，治以咸寒，佐以甘苦之剂”。方中连翘、金银花具芳香辟秽、辛凉解表的功效，为本方君药；薄荷、牛蒡子、荆芥、淡豆豉助银花、连翘解表散邪以为臣；金银花临床应用于治疗疮疡、泻痢、外感、热病、呼吸道感染、头痛咽痛等疾病；桔梗具有祛痰止咳、可宣利肺气之功，与牛蒡配伍又可清利咽喉；竹叶、芦根具有生津止渴、清热除烦等功效；连翘与竹叶相配具有引热下行、清心利尿、以防温邪逆传心包等功效；生甘草调和药性，为使药，全方组方为经典之作。多年来，临床上治疗各种感染性疾病如甲型H1N1 流感、手足口病、上呼吸道感染、肺炎等[2-5]疗效显著，倍受各代医贤所推崇。

内毒素侵入机体血液，可激活全身的防御系统，触发体内一系列病理生理过程，引起发热、休克、弥漫性血管内凝血、多器官功能衰竭，甚至导致死亡。随着对内毒素血症研究的不断深入，人们越来越清楚地认识到内源性炎性细胞因子在感染引起的炎症反应中起着重要的作用。IL-6 属前炎症细胞因子（CK）及早期CK[6]，可对机体损伤作出快速反应，在60 min 内释放。TNF-α 被认为是内毒素诱导的引起机体细胞损害的重要炎症介质，可由多种细胞产生，并可诱导产生多种其它细胞因子而增强炎症的瀑布效应，内毒素血症刺激炎症因子TNF-α 的异常释放，诱发全身炎症反应，导致多器官功能障碍综合征（MODS）的发生[7-8]。前期临床研究观察到卫分证时，IL-6、TNF-α 明显增高[9]。

本研究发现，运用银翘散在早期可缓解内毒素血症的全身反应，并能抑制IL-6、TNF-α 的表达，控制内毒素血症兔的炎症连锁反应，动物实验也证实银翘散在卫分证可以调动机体自身抗病能力，控制炎症的发展，截断病程，证实银翘散是临床行之有效的方剂，为其在临床的运用提供了客观的实验依据。

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