IL－1βmRNA在脑梗塞大鼠脑组织表达及针药结合治疗后的免疫干预机制*

颜培宇，王亚贤，于晓红，代巧妹

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

脑梗塞是我国中老年人的常见病、多发病，具有致残率高、死亡率高等临床特点。近年来的研究表明，脑梗塞发生的病理过程中存在炎症和免疫反应，致炎因子(IL－1β)在炎性反应过程中发挥重要作用，参与了脑组织的损伤和细胞凋亡过程。笔者运用针药结合的方法研究脑梗塞大鼠的脑组织IL－1βmRNA表达情况，并与单纯电针和单纯中药组进行了比较，现将结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康Wistar大鼠120只，体重280～350 g，雌雄各半。由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号:scxk(京)2007－0001。

1.2 药物与试剂

中药活脑康(丹参12 g，赤芍、五灵脂、鸡血藤、羌活、生地黄各9 g，甘草15 g)为黑龙江中医药大学附属医院药厂产品;Real Time PCR(HaiGene，SYBR Green荧光定量试剂盒)由上海西唐生物科技有限公司提供);引物合成及相关试剂由海基生物技术公司提供。

1.3 主要仪器

电针仪(G6805－2型，广东省汕头市医用设备厂);荧光定量 PCR 仪(ABI7500，ABI Corp，USA);Biometra－T PCR 仪(Biometra Corp.Genm)。

1.4 分组与造模方法

将大鼠随机分为5组，每组6只。即正常对照组(A)、模型组(B)、中药活脑康组(C)、电针组(D)和中药活脑康配合电针联合治疗组(E);C～E组根据治疗时间分为2 d、4 d、6 d和8 d组。B～E组采用Longa的腔内线栓法［1］阻滞大鼠右侧大脑中动脉，复制脑梗塞模型。造模后动物在自然苏醒后，选取出现右侧Honer征(提尾左前肢内收屈曲，爬行时向左侧划圈)的大鼠。

1.5 治疗方法

1.5.1 选穴及定位 选取“百会”及“大椎”两穴，取穴定位参照“十一五”国家规划教材《实验针灸学》［2］和《经络腧穴学》［3］大鼠标准穴位图定位及拟人对照法定位。

1.5.2 治疗方案 ①A组和B组每日给予生理盐水(6 g/kg)灌胃及绑缚固定;②C组于造模成功24 h后给予活脑康5 ml/支，含药量1.5 g，灌胃治疗，6 g/kg，每日一次;③D组于造模成功24 h后给予电针治疗，连续波，频率20 Hz，强度 1 ～2 mA，持续 30 min，每日一次;④E组于造模成功24 h后给予活脑康灌胃后进行电针治疗(同D、E组)，每日一次。

1.6 指标测定

各组实验大鼠分别于治疗2 d、4 d、6 d和8 d后，无菌取脑组织，迅速投入液氮中保存。采用RT－PCR法测定各组大鼠脑组织IL－1βmRNA表达情况。

1.6.1 引物 IL－1β 上游引物5'－ATAGCGTGACATTAAGAG－3';下游引物5'－GTGACGATAGTGATGACCT－3';βactin上游引物5'－ATCCCAAACAATACCCA－3';下游引物5'－CAACTATGTCCCGACCA－3'。

1.6.2 大鼠脑组织总RNA提取 ①组织于液氮条件下研磨粉碎，取100 mg装入1.5 ml EP管中;②向每管中加入1 ml的Trizol Reagent;③用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，室温静置5 min;④向上述裂解液中加入200 μl氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡15 s，待充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后，室温静置5 min;⑤12 000 g 4℃离心15 min;⑥从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相，吸取上清液转移至另一新的离心管中;⑦向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后20℃室温静置10 min，12 000 g 4℃离心10 min;⑧小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1 ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁。2～8℃12 000×g离心5 min，弃上清;⑨室温干燥沉淀5 min，加入100 μl无RNase的水，55～60℃放置10 min完成RNA提取。

1.6.3 反转录反应(HaiGene，cDNA第一链合成试剂盒) 在PCR管中配制混合液，在PCR仪上进行以下反应:65℃，5 min，然后置于冰上急冷。在PCR管中加入反转录反应液，在PCR仪上按以下条件进行反转录反应:30℃10 min，42℃30 ～ 60 min，95℃5 min，4℃。定量PCR仪:beta－actin标准曲线制作，样品5倍稀释，即为1、5、25、125 copy 数，扩增结果良好。β － actin溶解曲线制作，结果良好。P标准曲线制作，结果良好。样品5倍稀释，即为1、5、25、125 copy数，扩增结果正常。SP溶解曲线制作，结果良好。

1.7 统计学处理

数据采用 SPSS17.0统计软件处理。数据用均数±标准差表示。组间比较采用t检验。

2 结果

在脑梗塞造模后2 d，脑组织明显表达 IL－1βmRNA，4～8 d后，IL－1βmRNA 依然维持较高水平，与正常对照组比较有非常显著性差异(P＜0.01);治疗2天后，与模型组比较，电针组和针药结合组大鼠IL－1βmRNA表达明显下降，与模型组比较有非常显著性差异(P＜0.01);治疗4 d后，各治疗组大鼠IL－1βmRNA表达均明显下降，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。针药结合组疗效显著，且维持到治疗6 d和8 d后，与单纯电针组和单纯中药组比较差异有显著性(P＜0.05)。电针组和中药组比较无显著性差异(P ＞0.05)。见表1。

表1 针药结合对脑梗塞大鼠脑组织IL－1βmRNA表达的影响(±s)

表1 针药结合对脑梗塞大鼠脑组织IL－1βmRNA表达的影响(±s)

注:与模型组比较，*P＜0.01;与模型组和中药组比较，＊＊P＜0.05;与电针组和中药组比较，▲P ＜0.05;与中药组比较，＊▲P ＞0.05。

组别n 治疗后不同时间点IL－1βmRNA 表达量2 d 4 d 6 d 8 d正常对照组 6 0.91 ±0.18* 0.79 ±0.11*0.87 ±0.16*0.84 ±0.14*模型组 6 2.22 ±0.08 2.11 ±0.07 2.04 ±0.08 2.02 ±0.13电针组 6 1.68 ±0.31＊＊1.89 ±0.16 1.75 ±0.14 1.46 ±0.22＊▲中药活脑康组 6 2.21 ±0.09 1.61 ±0.25 1.61 ±0.24 1.30 ±0.25电针配合中药活脑康组6 1.35 ±0.26＊＊1.15 ±0.16 1.14 ±0.12 0.77 ±0.09▲

3 讨论

脑梗塞是严重危害人类健康的一种常见病、多发病。梗死后炎症反应是神经细胞死亡的重要原因［4］。IL－1是一种前炎性细胞因子，可在健康大鼠脑皮质、海马部位低水平表达［5］，当脑梗发生后，中枢神经系统内小胶质细胞分泌IL－1增加，形成局部炎症，引发神经组织细胞损伤和死亡，加重脑部炎性反应和水肿，引起一系列病理过程［6］。在一系列炎性因子中，IL－1β与炎症反应密切相关［7］。近期研究发现，致炎因子(IL－1)等可激活局部血管内皮细胞和白细胞，诱导细胞大量的牢固黏附，导致微血管阻塞，从而加重脑细胞损伤。近年来，人们对脑梗死的临床治疗进行了大量的研究［8－10］，针药结合不失为协同增效的更好方法。本项研究旨在前人研究的基础上，探索针药结合的有效治疗机制，尤其是这一传统的治疗方法对机体免疫系统的调节机制，以期为临床治疗和基础研究工作提供更新的数据，为针药结合的推广使用奠定基础。

中药活脑康是本院药厂自主研发的复方，在临床用于治疗脑梗塞患者，取得了满意的疗效。主要由丹参、赤芍、五灵脂、鸡血藤、羌活、生地黄和甘草等中药组成，配合电针治疗脑梗塞患者疗效显著。为了研究其临床有效性的免疫调节机制，本课题组申报了这一项目，开展了相关研究工作。实验结果表明，中药活脑康对脑梗塞大鼠免疫途径的干预作用，表现在中药活脑康组与模型组比较，在治疗4 d后IL－1βmRNA表达降低;在治疗6 d和8 d后IL－1βmRNA表达持续降低。表明中药活脑康可抑制脑梗塞大鼠脑组织IL－1βmRNA表达，对脑损伤有一定的保护作用。电针脑梗塞大鼠免疫途径的干预作用，表现在电针组与模型组比较，治疗2 d后IL－1βmRNA表达即降低;在治疗4 d、6 d和8 d后IL－1βmRNA表达虽降低，但与针药结合组比较疗效不显著。表明电针可在早期抑制脑梗塞大鼠脑组织IL－1βmRNA表达，对脑损伤有一定的保护作用，但有时间窗效应。电针配合中药活脑康组(针药结合组)对脑梗塞大鼠免疫途径的干预作用，表现在与模型组比较，在治疗4 d后IL－1βmRNA表达明显降低;在治疗6 d和8 d后IL－1βmRNA表达持续降低，疗效优于单纯电针组和单纯中药活脑康组。表明针药结合的治疗方法可持续抑制脑梗塞大鼠脑组织IL－1βmRNA表达，对脑损伤有一定的保护作用。

4 结论

脑梗塞大鼠脑组织内IL－1βmRNA表达显著升高，电针在治疗早期效果显著，针药结合方法可在治疗中后期维持这种治疗作用，进而控制炎性损伤，促进脑组织修复，随着治疗时间的延长，这种优势更加明显。

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