藤黄酸对骨肉瘤中hTERT和Bcl－2蛋白的影响

单玉兴，张海玉，王立君，万法青，卢良杰

（吉林大学白求恩医学部第一医院1.骨科；2.儿外科，吉林 长春130021）

藤黄酸（gambogic acid，GA）为新型抗肿瘤药物，对正常组织细胞无副作用，是很有发展前景的抗肿瘤药物［1］。端粒酶在肿瘤细胞的发生，发展中所起的作用已被认可。90%以上的肿瘤细胞都具有较高的端粒酶活性，而多数的体细胞则缺少端粒酶活性［2］。端粒酶以自身的R N A为模板逆转录合成端粒D N A重复序列并添加到端粒末端，以补偿因细胞每次分裂而丢失的末端碱基，保证染色体结构的稳定性和完整性，为肿瘤细胞的永生化提供了条件。端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶的限速成分，hTERT基因的表达调控对端粒酶表达活性调节起决定性作用，Bcl－2基因（即B细胞淋巴瘤／白血病－2基因）是一种原癌基因，具有抑制细胞凋亡的作用。hTERT和Bcl－2蛋白都是很好的肿瘤治疗靶点，本实验通过研究GA对骨肉瘤细胞中hTERT和Bcl－2蛋白的影响，为GA治疗骨肉瘤的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤细胞株（HOS和CCK8）购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。GA购于北京易莱西诺生物科技有限公司。主要试剂：胎牛血清（HyClone）购于赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司。hTERT抗体购于Santa Cruz公司；Bcl－2抗体，DAB显色试剂盒，免疫组化染色试剂盒（SP试剂盒）均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在5%CO2、饱和湿度、37℃孵箱中传代培养，培养基为含10%胎牛血清和100μ／ml双抗的高糖DMEM（含酚红）。

1.2.2 CCK－8法检测细胞增殖状况 将细胞种植于96孔板中，每孔5×103个细胞。培养24h后，每孔分别加入终浓度为0.125，0.25，0.5，1，2，4，8 μmol／L，含有 GA的培养基200μl，同时设一不加药物组，置于培养箱内继续培养24h，48h，72h，96 h，120h后每孔加入CCK－8溶液20μl，培养箱内继续培养4h。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值；在显微镜下观察细胞形态并照相。以时间为横轴，吸光值为纵轴绘制细胞生长曲线。细胞存活分数（survival fraction，SF）计算公式为：SF（%）＝（实验组 OD值／对照组 OD值）×100%。实验进行3次，最后以3个平行样品的SF均值±标准差（±s）绘制时间－存活曲线。

1.2.3 免疫组化检测hTERT和Bcl－2蛋白的表达

将细胞种植于24孔板中，每孔4×105个细胞，设置2个实验组，每组3个平行样，同时设立对照组。培养24h后，每孔加入含有最适浓度GA培养基1 ml，培养3d，5d。采用链霉素亲生物素－过氧化酶联接法（SP法）。常规固定，染色，10倍倒置显微镜下，选取具有适当形态学特征的细胞照相。应用Image J软件和Image Pro Plus软件对免疫组化图像进行半定量分析。

1.3 统计学分析

统计学处理：采用SPSS软件进行统计学处理。数据以（±s）表示，组间比较采用t检验，相关分析采用配对卡方检验，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 GA作用后细胞存活 细胞存活曲线描述了不同药物剂量在不同时间骨肉瘤细胞存活情况。见图1。

骨肉瘤HOS细胞的存活率随着时间的推移明显降低，而且未见明显的后期细胞增殖。相关性分析结果显示，细胞的存活率与药物剂量呈负相关（P＜0.01）。

2.2 hTERT和Bcl－2蛋白检测 应用Image Pro Plus软件对免疫组化图像分析表明各图像灰度值逐渐增强，说明各图像蛋白含量逐渐减低。数据显示实验组的hTERT和Bcl－2蛋白表达明显低于对照组，且表达强度明显与时间呈负相关。（见表1）。

图1 凋亡率与时间、药物剂量之间的关系

表1 免疫组化图像灰度值分析

应用Image J软件对免疫组化图像进行阳性细胞计数，阳性细胞越多，说明表达hTERT和Bcl－2蛋白的细胞越多，也就意味着表达hTERT和Bcl－2蛋白的细胞分布之广，反之亦然。经配对卡方检验，差异有显著性（P＜0.05）.（见表2）

表2 免疫组化图像阳性细胞数分析

2.3 hTERT和Bcl－2蛋白表达的关系 通过配对卡方检验，发现hTERT和Bcl－2蛋白的表达具有高度的一致性，两者表达具有显著相关性（P＜0.05）。

3 讨论

本实验在了解hTERT与Bcl－2蛋白的诸多行为关系的基础上，旨在了GA对骨肉瘤（HOS）中hTERT和Bcl－2蛋白的影响及可能相关性，同时为GA的临床应用提供理论依据。

骨肉瘤（成骨肉瘤）是最常见的恶性骨肿瘤。发病率很高，典型骨肉瘤一般见于10－20岁年龄段，但在任何年龄段都可发生，包括婴幼儿，儿童以及老年人。男性发病率较高，男女之比约2∶1。具有很强的局部浸润能力和肺转移能力。手术治疗已大大提高了患者的预后，但有很高的致残率。

常规化疗副作用大，且预后较差。GA为抗肿瘤一类新药，已进入临床研究。目前研究表明GA在有效剂量范围内毒副作用比较小，其抗癌作用与一般的化疗抗癌药有所区别，能选择性的杀死癌细胞，而对正常组织细胞无明显影响，有很好的发展前景。

端粒酶在90%的癌细胞中高表达，而在正常细胞中表达很少，是公认的抗癌靶点，可反映化疗的效果［3］。而端粒酶活性受hTERT 的调控［4，5］，是端粒酶的限速酶［6］，与端粒酶活性具有平行关系［7，8］。目前很多学者将目光转向hTERT，希望能够有所突破［9］。Bcl－2基因是大家关注热点，已有大量文献报道Bcl－2蛋白可保护细胞免于凋亡，同时提高hTERT 的表达［10－12］，但是也有实验证实 Bcl－2蛋白与hTERT 无相关，甚至负相关［13，14］。

本实验发现未经处理的骨肉瘤细胞在光镜下观察主要为短梭形，细胞排列紧密，核大，核分裂多见，细胞密集时呈多层生长。经GA处理后，细胞形态变成以多角形为主，单层排列，细胞大小趋向均一，核小而深染，提示形态上出现分化改变。随着药物浓度的增高，骨肉瘤细胞的凋亡率明显增大；随着药物作用时间的延长，细胞的凋亡率也明显增大。在最适浓度的作用下，以时间为轴线，在对照组中，hTERT和Bcl－2蛋白的表达无明显变化；在实验组（3d），实验组（5d）中，hTERT和Bcl－2蛋白的表达在逐渐减弱，与药物作用时间呈负相关，与相关报道一致［15，16］；二者与药物存在时间依赖关系，在表达上呈高度一致性。

GA、hTERT存在时间依赖关系，但是并不确定GA是否直接影响端粒酶活性；Bcl－2蛋白与hTERT存在高度一致性，二者之间是否存在互相协助的作用，有待进一步研究；因部分正常组织中存在端粒酶活性，所以GA对其有无副作用，同样有待进一步研究；hTERT和Bcl－2基因蛋白的表达的测定是半定量的，还存在某些假阳性和假阴性的可能；肿瘤细胞内为低PH状态［17］，但本实验的肿瘤细胞是在pH7.2－7.4状态下进行的，这不能反映体内恶性肿瘤组织的低PH状态。以上问题有待进一步论证。

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