环介导等温扩增技术快速检测痰标本中结核分枝杆菌的初步评价

于 霞，梁 倩，马异峰，付育红，黄海荣

（北京市结核病胸部肿瘤研究所，首都医科大学附属北京胸科医院，北京101149）

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的流行最广的传染性疾病。全球每年新发结核患者800－1000万，有180万人死于结核病［1］。涂片和培养是结核病诊断最为直接和可靠的诊断依据，但其自身的不足已严重影响实验室技术对结核病防治的价值。传统诊断技术的不足主要有：（1）诊断技术敏感性低，涂片镜检对菌阳标本的检出率只有40%－50%。（2）分枝杆菌培养虽然较涂片镜检的检出率高，能达到85%，但耗时长，通常需要6－8周。

由于分子生物学诊断技术逐步被开发，其敏感性和特异性以及实用性已经得到认可。环介导等温扩增（LAMP）技术就是其中之一，该技术通过特异的引物与结核分枝杆菌染色体DNA的DNA gyrase subunit B （gryB）以 及insertion sequence（IS6110）区域结合，采用2对引物识别6个区域，在恒温条件下进行扩增［2］。该技术的优点为特异性高，扩增反应效率高，时间短产物量大，不需昂贵的仪器，操作简易性好。

1 材料与方法

1.1 标本收集 收集本院2012年6－8月的疑似肺结核患者的痰标本246份。年龄范围18到88岁，平均年龄49岁，男179份，女67份。经临床诊断确诊的结核病患者标本213例，其他肺部疾病标本33例。

1.2 分枝杆菌培养和涂片 对收集的痰标本进行荧光法涂片镜检，痰标本的收集和涂片镜检按照《痰涂片镜检质量保证手册》进行操作。中性罗氏培养基的制作见参考文献［3］，取1ml痰标本，加入1－1.5倍体积4%用N－乙酰－L－半胱氨酸－氢氧化钠溶液进行消化，旋紧盖子，在涡旋振荡器上涡旋震荡10－20 s，直至痰标本充分液化。将离心管室温静置15 min，加入PBS中和至体积为40ml，3 000g离心15 min。取100μl处理后的样品分别接种至中性罗氏培养基斜面上。每份标本平行接种至两管中性罗氏培养基。37℃温箱培养，每周观察记录结果。

1.3 菌种鉴定 采用杭州创新生物检控技术有限公司生产的结核分枝杆菌快速诊断试剂盒（胶体金）对罗氏培养阳性的痰标本进行菌种鉴定。试剂盒原理为结核分枝杆菌生长时产生分泌型蛋白MPB64，而非结核分枝杆菌（Non－tuberculosis mycobacteria，NTM）不会产生MPB64。质控和测试条带均为红色时，样本中含结核分枝杆菌；只有质控条带为红色时，样本中含有NTM。

1.4 实时荧光核酸扩增（RT－PCR） 采用达安基因股份有限公司生产的结核分枝杆菌DNA提取试剂盒进行核酸提取，然后按照标准曲线试剂盒进行操作，使用实时荧光核酸扩增仪（ABI7500）进行扩增，按试剂盒说明进行检测。

1.5 环介导的等温扩增技术（LAMP）

1.5.1 DNA提取 采用核酸快速提取试剂盒（荣研生物科技（中国）有限公司），该试剂盒通过对样本中所含的细菌进行破碎处理，使其所含的核酸游离到溶液中，并将得到的溶液与吸附剂试剂管中的多孔介质混合，把样本中所含的阻碍核酸扩增反应的物质去除，在通过滴注盖薄膜滤器，使核酸溶液被提取出来。

1.5.2 LAMP扩增 将30μl的核酸溶液加到反应试管中；将恒温器在67℃加热40min；40min后再用加热器进行酶的灭活，80℃，5min。结果判定：使用紫外照射灯管从反应试管的地面进行紫外照射。在确认阳性对照发出绿色荧光，阴性对照溶液没有发出荧光后，对待测样本结果进行判读。阳性：发出绿色荧光。阴性：未发出绿色荧光。

1.6 临床诊断 依据中华医学会结核病学分会《肺结核诊断和治疗指南》［4］。

1.7 统计分析 采用SPSS 13.0软件进行数据分析，LAMP与RT－PCR法检测结果比较用配对χ2检验；LAMP与RT－PCR法检测结果一致性分析采用Kappa指数法，Kappa系数值越大，说明吻合程度越高。Kappa指数在0.4－0.7，提示吻合程度一般，大于0.7，说明吻合性强。

2 结果

2.1 4种方法的检出率

痰涂片，痰罗氏培养，LAMP扩增以及RTPCR四种方法对分枝杆菌的检出率依次为30.89%（76／246），45.53%（112／246），54.47%（134／246），57.32%（141／246）。RT－PCR 的检出率最高，其次为LAMP。LAMP与RT－PCR在结核分枝杆菌检出率上的差异无统计学意义（配对χ2检验结果，P＝0.189，P＞0.05）。LAMP法与涂片法在结核分枝杆菌检出率上的差异有统计学意义（配对χ2检验结果，P＜0.001）。LAMP法与培养法在结核分枝杆菌检出率上的差异有统计学意义（配对χ2检验结果，P＜0.001）。

2.2 菌种鉴定结果 对于罗氏培养阳性的112株分枝杆菌进行胶体金试剂盒鉴定，其中7株（7／112，6.25%）株为NTM，其余105株为结核分枝杆菌。

2.3 LAMP法与罗氏培养法检测结果的比较 对于胶体金鉴定为NTM的7株菌株，在进行LAMP法与罗氏培养的比较时排除这7株菌株。以罗氏培养结果作为金标准，LAMP法诊断的敏感性为96.19%（101／105），特异性为76.87%（103／134），两法检测结果的一致性是κ＝0.711，说明LAMP法在检测结核分枝杆菌方面与罗氏培养法有较好的吻合性。两法检测结果的比较见表1。

表1 LAMP法与罗氏培养法检测结果的比较

2.4 LAMP法与涂片法、RT－PCR法以及临床诊断结果的比较

以RT－PCR作为诊断标准，LAMP法的敏感性为90.07% （127／141），特异性为93.33% （98／105），两法检测结果的一致性是κ＝0.83，说明LAMP法在检测结核分枝杆菌方面，与RT－PCR法有很好的吻合性。以涂片结果作为金标准，LAMP的敏感性为96.05%（73／76），特异性为64.12%（109／170）。以临床诊断作为金标准，LAMP的敏感性为62.74%（133／212），特异性为97.06%（33／34）。LAMP法与其他3种方法比较，见表2。来自不同临床诊断类型的痰标本，四种不同检测方法的检出率如表3所示。

表2 LAMP法与涂片、RT－PCR和临床诊断结果的比较

其他非结核性疾病包括肺癌5例，胸腔积液3例，肺炎4例，支气管扩张合并感染1例，多浆膜腔积液1例。

表3 四种不同检测方法对于来自不同临床诊断类型标本的检出率

3 讨论

根据全国结核病耐药性基线调查报告，NTM在培养阳性菌株中所占的比例为3.4%［5］。在本研究中，NTM在培养阳性菌株中的比例约6.25%（7／112）%。LAMP技术的引物设计在结核分枝杆菌染色体DNA的gryB以及IS区域内，从理论上讲，只能对结核分枝杆菌进行诊断而无法识别NTM菌株。因此计算LAMP与培养的一致性时，应该先排除NTM菌株的影响。在7株经胶体金鉴定为NTM的菌株中有2株的LAMP法和RT－PCR均为阳性且临床诊断均为结核病，提示这两份标本可能存在混合感染，即一份痰标本中同时含有结核和NTM。因此，当LAMP结果为阳性且胶体金为阴性时，提示检测样本可能存在混合感染。

一系列的研究表明，LAMP法与培养法有着较好的吻合率。刘毅［6］等研究表明以培养法为金标准，选取121份痰标本，LAMP法的敏感性和特异性分别为92.16%和87.14%。易海华［7］等研究选取65份痰标本，以培养法为金标准，LAMP法的敏感性和特异性分别为96.4%和94.59%。包维华［8］等研究，选取118份痰标本，以培养法为金标准，LAMP法的敏感性和特异性分别92%和86.8%。戴广明等［9］研究表明选取了79株临床和标准菌株，与培养相比，LAMP法实验的灵敏度和特异性分别为100%和92%。Geojith George等研究表明在涂片和培养结果一致的标本中，LAMP方法很有效［10］。同时，LAMP技术对于脑脊液标本也有很高的检出率［11］，与临床诊断的敏感性和特异性分别为52.9% 和90%。本实验以罗氏培养结果作为金标准，LAMP法诊断的敏感性为96.19%（101／105），LAMP的特异性为76.87%（103／134），两种方法检测结果的一致性是κ＝0.71。

痰标本的细菌载量在5000－10000条／ml，涂片镜检才会报告阳性。而痰培养得细菌载量在100条／ml以上，培养会报告阳性［12］。本实验所用的LAMP的最低检出限为0.38基因组／测试。因此，涂片培养阴性并不代表痰标本中没有结核分枝杆菌，有可能是由于细菌的数量低于检测限造成的。在结核分枝杆菌检出率上，LAMP法（134／246，54.47%）要高于涂片法（76／246，30.89%）和罗氏培养法（112／246，45.53%），且差异有统计学意义。

LAMP法与RT－PCR在检出率上的差别没有统计学意义（P＝0.189），两法检测结果的一致性是κ＝0.83。RT－PCR已经作为一种辅助检查项目在国内的医院广泛开展，其结果也可以作为菌阴肺结核的诊断指标之一［4］，检测时间约为3个小时，但需要价格较为昂贵的设备，通过对扩增反应曲线图谱来判读结果，对操作人员的技术要求较高。LAMP试剂盒可以在2小时内报告结果，且仅需颜色的变化来判读结果，操作更为简单。因此，LAMP法适合作为临床检测项目开展。

［1］卫生部疾病预防控制局.卫生部医政司 .中国疾病预防控制中心.中国结核病放置规划实施工作指南.北京：中国协和医科大学出版社.2006，1－9.

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［4］中华医学会结核病学分会.肺结核诊断和治疗指南［J］.中华结核和呼吸杂志，2001，24（2）：70.

［5］中华人民共和国卫生部.全国结核病耐药性基线调查报告（2007－2008年）.北京：人民卫生出版社：23－25.

［6］刘 毅，黄曙海，谭慧媚，等.环介导等温扩增技术检测肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌［J］.临床检验杂志，2012：30（1）：24.

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