潮州地区人乳头瘤病毒52型L1基因多态性分析

罗招云，陈 强，杨立业，林 敏，陈默蕊

（1.南方医科大学附属潮州中心医院 检验实验中心，广东 潮州521000；2.吉林大学公共卫生学院）

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，仅次于乳腺癌占恶性肿瘤的第二位［1］。研究证实高危型人乳头瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR－HPV）持续感染是宫颈癌及其癌前病变发生的最重要危险因素［2］。目前关于16及18型HPV的报道很多，对52型的研究较少见。HPV52作为HPV16簇群中的成员，具有高度致癌性的HPV型别，在亚洲等地呈现特殊的流行状况，逐渐引起人们的关注。HPV52是潮州地区 HR－HPV优势基因型别（30.55%，1005／3290）［3］。由于 HPV52与不同遗传背景的宿主相互作用会引起病毒的变异，影响HPV感染和转归，了解HPV52基因多态性将为明确宫颈癌的发生和运用免疫学策略预防HPV52相关疾病提供新的思路。由于源于中国内地的HPV52基因序列较少，本研究在潮州地区采集女性宫颈脱落细胞标本，进行HPV分型和HPV52L1测序，将所获得的HPV52L1序列与GenBank基因库中的联合进行系统全面分析，探讨HPV52L1基因多态性。

1 材料与方法

1.1 样本来源 取自2009年8月至2010年8月间潮州地区农村女性宫颈癌筛查的49458份宫颈脱落细胞标本（年龄35～60岁，平均46.98岁，均为生育女性，先前均无宫颈手术史）。先进行HR－HPV 13种高危型别的实时荧光定量PCR筛查（杭州博日），阳性者再进行21型核酸分子快速导流杂交分型检测（凯普生物技术有限公司）。HR－HPV阳性者同时进行液基薄层细胞学检查（LCT）。LCT检查采用广州安必平医药公司提供的制片仪器（LBP－2801）及其配套试剂，以 The Bethesda System（TBS）报告系统为诊断标准。选择单纯HPV52型感染阳性的标本为研究对象。

1.2 标本的采集 此次宫颈癌筛查活动通过了潮州市中心医院伦理委员会的批准。标本采集前由受检者签署知情同意书。由专科医生使用凯普公司专用宫颈刷完成。扩阴器暴露宫颈口后，棉拭子擦去分泌物，宫颈刷顺时针刷转3～5圈后将宫颈刷保存于样品管的保存液中。

1.3 DNA模板的制备 DNA提取试剂盒（凯普公司生物技术有限公司），标本制备按说明书操作。

1.4 目的序列PCR扩增和测序 HPV52L1PCR以上述提取DNA为模板。HPV52L1引物设计根据GenBank基因库天津参考株（TJ49－52，ACCESSION：GQ472848）序列设计特异性引物，并经Primer5.0分子生物学软件分析优化。参考Gen－Bank基因库中HPV52L1区通用型引物 MY09／MY11， MY09：5’－CGTCCMARRGGAWACTGATC－3’， MY11： 5 ’－GCMCAGGGWCATA－AYAATGG－3’；因L1基因序列全长1590bp较长，故将L1分为4个区段，自行设计HPV52L1区段特异引物正反向4对，分别为HPV52－L1－1，

F：5′－CCATTACCTTCGTTACCCACA－3′，

R：5′－AGGATGCCCACTAATACCC－3′HPV52－L1－2，

F：5′－GCTTGGAAATCGGTAGGG－3′，R：5′－GCAGTATTGCCAGAGTTAGACC－3′HPV52－L1－3，

F：5′－AGGGTCTAACTCTGGCAATAC－3′，

R：5′－CCTGTAGCCCTGCCTGTA－3′HPV52－L1－4，

F：5′－ATGAAAATTTTAAGGAATACC －3′，

在2017—2018秋季学期“生物化学”课程的教学中，采用“大班授课、小班研讨”、“设计问题和案例”、“网络平台实现师生互动”、“改变成绩评价体系”等方面的教学改革，在提高大班型授课效率方面取得了一定成效，并对上课模式和效果进行了无记名问卷调查，向参与的学生（参与传统教学问卷为120人，参与教学改革后问卷为110人）提出了5个问题。

R：5′－ACATACATAACATGCAAACAAC－3′上述引物均由Invitrogen生物技术有限公司（上海）合成。PCR扩增仪为ABI2700热循环仪。L1基因PCR反应条件：50μl反应体系（包含2μl模板DNA，灭菌去离子水34.0μl，10×PCR Buffer 5.0 μl，dNTPs 4.0μl（0.2mmol／L），DMSO为1μl，引物P1，P2各1.6μl（0.4μmol／L），Taq DNA 聚合酶1U／0.8μl）；L1－1反应条件为：93℃5min后进行循环，93℃1min，52℃1min，72℃1min，36个循环，最后72℃延伸10min。取10μl PCR反应产物在2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果并照相。L1－2、L1－3、L1－4的反应条件与 L1－1只有第三步的退火温度不同，分别为 L1－2（52℃），L1－3（57℃），L1－4（57℃），其它步骤与 L1－1完全一致。HPV52 L1PCR反应产物送广州英潍捷基（上海）贸易有限公司双向测序，对测序结果进行分析。Taq酶、dNTPs、PMD18－T载体为TakaRa公司产品。

1.5 HPV52L1区段序列测定 因L1序列全长1 590bp较长，故将L1分为4个区段，分别用L1－1、L1－2、L1－3、L1－4进行 DNA 测序，测序后再拼接。利用BLAST将所测序列与GenBank基因库中HPV52序列进行比对。

1.6 序列分析 通过BioEdit软件工具向Gen－Bank核酸数据库提交，利用BLAST和DNA STAR等在线分析工具对所获得序列进行分析，将所测序列与GenBank基因库中天津参考株（ACCESSION：GQ472848）的HPV52L1编码区序列进行比对。对出现的变异进行多态性分析。本研究获得的73株组成数据集，合并全同序列，然后分组。将潮州地区的HPV52L1变异株基因序列上交NCBI GenBank基因库。

1.7 建立 HPV52－L1进化树 通过BioEdit、Clustal－1.8和 Mega－5.05软件工具，以及利用 NCBI→BLAST在线分析工具，按照构建系统进化树的步骤操作。

2 结果

2.1 HPV52L1基因的PCR扩增结果及初步鉴定以选取的101例HPV52单纯感染者宫颈脱落细胞 DNA 为模板，成功获得 L1－1、L1－2、L1－3、L1－4各83份PCR扩增阳性产物，PCR扩增产物长度分别为：L1－1为526bp、L1－2为547bp、L1－3为596 bp、L1－4为560bp。PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳后，分别在相应位置附近显示一条特异DNA条带，其大小与预期值一致，见图1。

图1 HPV52－L1中4片段PCR扩增产物琼脂糖电泳图

2.2 HPV52－L1序列测定和分析 将83份L1－1、L1－2、L1－3、L1－4PCR扩增阳性产物进行正、反双向测序，成功获得正、反各73条 L1－1、L1－2、L1－3、L1－4基因序列，利用BioEdit和DNA STAR等在线分析软件将 L1－1、L1－2、L1－3、L1－4再拼接成 HPV52 L1全序列。利用DNA STAR／Edit Seq软件分析，以天津参考株L1编码区序列中起始密码和终止密码处小片段，找到相对应的起始密码和终止密码，起始密码和终止密码之间的基因序列就是所测的L1编码区序列，再利用BLAST在线分析工具，将HPV52L1基因序列与GenBank收录的天津参考株L1编码区序列进行比对，一致性均为99%。对73条HPV52L1核苷酸序列进行同源性分析，L1基因型内核苷酸同源性为99.1%～99.9%，符合分型规律［4］。

表1 HPV52－L1基因测序结果与潮州地方株比对碱基突变类型和位置

2.4 HPV52L1 15组序列进化树之间的关系 进化树中上部分的潮州地区的12组编码序列与广州的、天津的、浙江等国内的和泰国、印度等东南亚国报道株亲缘关系最近；进化树中下部分的CZ52D416组编码序列与 TJ49－52（GQ472848）株和 Qv03594（HQ537740）株亲缘关系最近；进化树下部分的2组（CZ52E928、CZ52E136）编码序列与哥斯达黎加和德国等美欧国家报道的株亲缘关系最近，见图2。

图2 HPV52－L1 15组序列进化树

2.5 HPV52不同突变株的Accession号和73株感染者的LCT结果 将潮州地区15株不同的HPV52 L1变异株基因序列上交GenBank基因库，获得15株 的 Accession 号，GenBank accession codes：JN874416、JN874417、JN874419 ～ JN874428、JN874430、JN874434、JN874436。为了了解 HPV52 L1变异株的致瘤性，比较不同的HPV52L1变异株群的宫颈病变严重程度差别，其中CZ52A105组中有1例高级别鳞状上皮内病变（high grade squamous intraepithelial lesions，HSIL），CZ52A277组为1例鳞状细胞癌（squamous cell cancer，SCC）见表2。

3 讨论

研究表明HPV52在中国和亚洲妇女中常见［5］。某些地区甚至高于 HPV16和 HPV18，在上海、四川、广东等地，高发态势尤为明显［6］。HPV52作为HPV16簇群中的成员，是具有高度致癌性的HPV型别之一［7］，在亚洲等地呈现特殊的流行状况。L1基因是HPV晚期结构蛋白基因，有较强的抗原性和免疫原性，能诱导机体B细胞产生中和抗体，从而阻断病毒感染，因而L1蛋白是防治HPV感染基因工程疫苗研究的重要靶抗原［8］。研究证实，不同地域间HPV L1基因存在变异现象［9］。国内研究发现扬州地区L1基因存在7处变异［10］。本研究发现，潮州地区HPV52L1基因序列有31处碱基分别出现变异，其中6处由于核苷酸的改变，其编码氨基酸也相应发生变化；另外25处为同义突变，未影响氨基酸的改变。提示HPV52L1编码基因中可能存在一系列中国地区的高频率突变位点；结果也提示潮州地区不同L1基因序列之间存在差异，特别是氨基酸的改变，可能会造成HPV52L1蛋白免疫原性的差异。有学者报道HPV不同的变异株与子宫颈鳞状上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）程度相关［11］。HPV16的亚美或非洲变异株比欧洲变异株具有更强的发生宫颈癌的危险性［12］。本研究分析了潮州地区HPV52L1基因的突变谱及主流型，并预测了其功能变化。L1蛋白的改变将导致病毒的组装、感染以及抗原表位的改变，使病毒逃避机体免疫识别，从而造成病毒的持续和重复感染，促进宫颈癌的发生［13］。提示L1基因突变为HPV52型种系发生提供了确凿的资料，也为HPV52型预防性疫苗研制提供新的思路和基本条件。潮州地区的L1基因多态性形成15种突变模式，分为东亚和欧洲2种谱系。主流突变的东亚群L1基因序列多与国内的（广州、天津、浙江等）和东南亚地区（泰国、印度、香港、台湾等）报道的HPV52株同源；欧美群L1基因序列与哥斯达黎加和德国等欧美国家报道的株亲缘关系最近。说明不仅在不同国家之间，即便在我国不同地区之间和不同检测对象之间，L1基因多态性也存在较大的差异。

表2 HPV52不同突变株的Accession号和LCT结果（n＝73）

综上所述，HPV52在亚洲CIN发生中可能占据重要地位。本研究探明了潮州地区HPV52L1基因结构特点和变异规律，为制备适合中国人群的HPV宫颈癌疫苗提供流行病学资料和理论依据。

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