LAT1和4F2hc在人脑胶质瘤中的表达☆
2013-11-23甄海宁河井信行冈田真树大久保修一田宫隆章翔刘卫平霍军丽费舟
甄海宁 河井信行 冈田真树 大久保修一 田宫隆 章翔 刘卫平 霍军丽 费舟
肿瘤细胞的快速生长有赖于活跃的能量代谢和大量的蛋白合成，而蛋白合成则需要充足的氨基酸供给[1]。大型氨基酸转运载体1（large-type amino acid transporter 1,LAT1）和细胞表面抗原4F2重链（4F2 heavy chain,4F2hc）可共价结合形成异源二聚体，以介导分枝型或芳香族必需氨基酸的跨膜转运，LAT1/4F2hc复合物是一种大型、中性氨基酸的主要转运载体[2]。近年来有关资料显示LAT1和4F2hc高表达与人类多种类型肿瘤的发生和发展密切相关[2]。为此，本研究采用免疫组化方法检测了LAT1和4F2hc在人脑胶质瘤组织中的表达状况，并进一步分析了其表达水平与胶质瘤病理级别、恶性程度以及二者表达之间的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象 62例脑胶质瘤患者为日本香川大学医学部附属医院脑神经外科自1995年10月至2010年2月收治的病例，男、女各31例，年龄3～89岁，平均（51.4±18.0）岁。脑胶质瘤标本经病理组织学检查确诊，按WHO 2007年分类和分级标准，包括Ⅰ级4例，均为毛细胞型星形细胞瘤；Ⅱ级14例，包括弥漫型星形细胞瘤6例，纤维型星形细胞瘤4例，肥胖细胞型星形细胞瘤2例，少突星形细胞瘤1例，室管膜瘤1例；Ⅲ级13例，包括间变型星形细胞瘤12例，间变型室管膜瘤1例；Ⅳ级31例，均为胶质母细胞瘤。低恶性度胶质瘤（包括Ⅰ级和Ⅱ级）18例，高恶性度胶质瘤（包括Ⅲ级和Ⅳ级）44例。蜡块连续切片，厚3µm。
1.2 免疫组化方法 采用聚合物-过氧化物酶（PP）免疫组化两步法。石蜡切片常规脱蜡至水，对于LAT1检测，将切片浸于0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（PH 6.0）中，行微波（500W）抗原修复10min；对于4F2hc检测，无需抗原修复。切片用0.3%H2O2于室温下孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性。用3%牛血清白蛋白（BSA）于室温下孵育30min，以封闭非特异性结合位点。一抗稀释度分别为：LAT1（日本Trans Genic）1:12.5，4F2hc（日本 Trans Genic）1:8。EnVision+/HRP 复合物液（丹麦Dako）于室温下孵育40min。二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染。分别以LAT1和4F2hc表达阳性的肺癌组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定 LAT1和4F2hc在瘤细胞中的染色情况参照Nawashiro等[3]的方法，根据染色细胞百分率和染色强度两个方面评定为-～+++。即在瘤细胞免疫反应最强的区域，于高倍视野（×400）下计数1000个细胞，阳性率≤50%为散在性染色，>50%为弥漫性染色。染色强度根据多数细胞的反应分为阴性、弱染色和强染色。瘤细胞染色分级为：无染色或弱散在性染色（-）、弱弥漫性染色（+）、强散在性染色（++）、强弥漫性染色（+++）。LAT1和4F2hc在血管内皮中的染色情况根据阳性微血管数（NMV）亦评定为-～+++。即在血管内皮免疫反应最强的区域，于高倍镜（×200）下观察3～5个视野，其平均NMV≤1为无染色血管（-）、1
1.4 统计学分析 采用SPSS 16.0进行分析，LAT1和4F2hc表达水平与胶质瘤病理级别、患者性别和年龄的关系以及二者表达之间的关系采用Spearman等级相关分析；LAT1和4F2hc在高、低不同恶性程度胶质瘤间表达水平的差异采用χ2检验。检测水准α=0.05。
2 结果
2.1 LAT1和4F2hc的定性和定位表达 LAT1和4F2hc在62例胶质瘤中均有不同程度的表达，其免疫阳性信号既定位于瘤细胞内也定位于血管内皮；二者在瘤细胞内的免疫染色主要位于胞浆和胞质膜，少量位于胞核；而在邻近肿瘤的11例正常脑组织中二者仅有可忽略不计的表达（图1）。
图1 LAT1和4F2hc在人脑胶质瘤中的表达。A：LAT1在毛细胞型星形细胞瘤（WHOⅠ级）血管内皮中弱表达（+）；B：LAT1在肥胖细胞型星形细胞瘤（WHOⅡ级）血管内皮中弱表达（+）；C：LAT1在间变型星形细胞瘤（WHOⅢ级）血管内皮中中等强度表达以及在瘤细胞胞浆中弱表达（++；D：LAT1在胶质母细胞瘤（WHOⅣ级）血管内皮中强表达以及在瘤细胞胞浆中中等强度表达（+++）；E：LAT1在胶质母细胞瘤（WHOⅣ级）瘤细胞胞浆和血管内皮中强表达（+++）；F：LAT1在邻近肿瘤的正常脑组织中无明显表达；G：4F2hc在毛细胞型星形细胞瘤（WHOⅠ级）胞浆中弱表达（+）；H：4F2hc在肥胖细胞型星形细胞瘤（WHOⅡ级）瘤细胞胞浆中中等强度表达以及在血管内皮中弱表达（++）；I：4F2hc在间变型星形细胞瘤（WHOⅢ级）胞浆和胞质膜中强表达（+++）；J：4F2hc在胶质母细胞瘤（WHOⅣ级）胞浆和胞质膜中强表达以及在血管内皮中中等强度表达（+++）；K：4F2hc在胶质母细胞瘤（WHOⅣ级）胞浆、胞质膜、胞核以及血管内皮中强表达（+++）；L：4F2hc在邻近肿瘤的正常脑组织中无明显表达。A和G、B和H、C和I、D和J、E和K、F和L分别为同一组织标本（×400，标尺=20μm）
2.2 LAT1表达与胶质瘤临床病理学特征的关系LAT1免疫染色强度随胶质瘤病理级别的升高而明显增强（rs=0.526,P＜0.01），其在高恶性度胶质瘤中的染色强度明显强于低恶性度胶质瘤（χ2=42.456,P＜0.01），见表1。
2.3 4F2hc表达与胶质瘤临床病理学特征的关系4F2hc免疫染色强度随胶质瘤病理级别的升高而明显增强（rs=0.413,P＜0.01），其在高恶性度胶质瘤中的染色强度明显强于低恶性度胶质瘤（χ2=40.026,P＜0.01），见表1。
表1 LAT1和4F2hc在人脑胶质瘤中的表达
2.4 LAT1和4F2hc表达之间的关系 LAT1和4F2hc表达水平存在明显正相关（rs=0.319,P＜0.05）。
3 讨论
LAT1和4F2hc分别由SLC7A5（solute carrier family 7 member 5）和SLC3A2基因编码，二者蛋白产物可以二硫键共价结合形成异源二聚体，即LAT1/4F2hc复合物，亦称CD98，是一种大型、中性氨基酸的主要转运载体，可介导多种分枝型或芳香族必需氨基酸的跨膜转运，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、组氨酸等[2]。近年来有关资料显示LAT1和4F2hc高表达与人类多种类型肿瘤的发生和发展密切相关[4-8]。
LAT1和4F2hc在人胶质瘤中的表达研究目前国外仅有个别报道，国内尚未见相关报道。Nawashiro等[3]采用免疫组化方法检测60例胶质瘤，包括Ⅱ级（纤维型星形细胞瘤）15例，Ⅲ级（间变型星形细胞瘤）17例，Ⅳ级（胶质母细胞瘤）28例。结果显示LAT1和4F2hc在胶质瘤标本中均有表达，而在肿瘤邻近的正常脑组织中无明显表达；LAT1表达随胶质瘤病理级别升高而明显增强，4F2hc表达有随胶质瘤病理级别升高而增强的趋势。Kobayashi等[9]采用Western blot方法检测23例胶质瘤，结果显示LAT1有随胶质瘤恶性度增高而表达增强的趋势，即在胶质母细胞瘤（9/12）和间变型星形细胞瘤（6/8）中其表达阳性率均为75%，而在弥漫型星形细胞瘤中其表达阳性率仅为33%（1/3），且在3例正常脑组织中均无表达；采用反转录PCR（RT-PCR）方法检测11例胶质母细胞瘤和7例间变型星形细胞瘤显示均有4F2hc mRNA的明显表达，而在1例正常脑组织和正常的人星形细胞中仅有微弱的表达。本研究结果与上述研究报道结果基本一致，也显示LAT1和4F2hc在脑胶质瘤中存在过表达，而在正常脑组织中二者仅有微弱的表达；不仅同样证实了LAT1表达与胶质瘤病理分级密切相关，而且证实了4F2hc表达也与胶质瘤病理分级密切相关，这提示LAT1和4F2hc共表达与人脑胶质瘤的发生和发展存在密切关系。
Nawashiro等[3]报道LAT1和4F2hc的免疫阳性信号主要定位于胶质瘤细胞的胞质膜和胞浆，并未报道二者免疫阳性信号在瘤组织血管内皮中的定位。本研究证实LAT1和4F2hc不仅表达于人脑胶质瘤瘤细胞内，而且表达于肿瘤血管内皮。这提示LAT1和4F2hc高表达不仅在从瘤细胞间液向瘤细胞内的氨基酸转运中发挥重要作用，而且在氨基酸透过血管内皮进入肿瘤细胞间质过程中同样发挥重要作用。以前的有关研究显示，LAT1和4F2hc确实表达于小鼠、大鼠和牛等动物脑组织中的血管内皮细胞，并指出二者这种表达定位对于介导大型、中性氨基酸穿越血脑屏障（BBB）具有重要意义[10]，以上相关研究可为本研究结果提供间接的有力支持。如前文所述，LAT1和4F2hc在本组胶质瘤中表达密切相关，但二者在瘤组织中的表达定位强度并非完全平行一致，即总体而言LAT1在血管内皮中的表达要强于瘤细胞，而4F2hc在瘤细胞中的表达要强于血管内皮，这提示LAT1和4F2hc表达存在不同的调节机制。研究表明，4F2hc共可与6个氨基酸转运载体亚单位共价结合形成异源二聚体而发挥包括中性、碱性和酸性多种氨基酸的跨膜转运作用，即除了隶属L系统的LAT1外，4F2hc还可与L系统的LAT2、y+L系统的y+LAT-1和y+LAT-2、asc系统的asc-1以及xc-系统的xCT（x-C-type transporter）亚单位结合[2]，这可以解释4F2hc在瘤细胞中有相对于LAT1更高的表达。而4F2hc在血管内皮中的表达相对于LAT1较低，提示这可能是氨基酸穿越血脑屏障的一种限速机制[10]。Nawashiro等[3]报道LAT1免疫阳性信号也少量定位于瘤细胞胞核，但作者分析这是染色造成的伪影所致。本研究显示LAT1和4F2hc免疫染色在瘤细胞中的确主要定位于胞质和胞质膜，但也少量定位于瘤细胞胞核。我们认为LAT1和4F2hc在瘤细胞胞核中的着色是特异性的，但其作用机制尚需进一步深入研究。
总之，本研究结果提示LAT1和4F2hc在人脑胶质瘤中存在过表达，并且其高表达与胶质瘤的病理分级和恶性程度密切相关，二者在人脑胶质瘤发生和发展中的作用机制值得进一步深入研究。
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