血脑屏障紧密连接损坏引起大鼠高血压性脑白质病变☆

杨娴 蓝琳芳 邢世会 曾进胜 范玉华

脑白质病变（white matter lesions，WML）又称脑白质改变（white matter changes,WMC），曾经也被称为白质疏松（leukoaraiosis）,影像学上表现为脑室周围或皮质下半卵圆中心区存在CT上的白质斑片状或弥漫性低密度灶，或MRI T2加权图像的高信号改变。其可以增加脑卒中、认知障碍、痴呆和死亡的风险。高龄和高血压是最重要的危险因素。然而，作为可以被干预的危险因素——高血压导致WML的有关机制尚未阐明。目前，血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏被认为与WML发病有关[1-3]。BBB最重要的结构是毛细血管内皮细胞的紧密连接（tight junction,TJ），TJ在高血压性WML中的变化及其促成脑白质病变的机制研究国内外均少有报道。原因方面是目前用于研究WML的动物模型包括双侧颈动脉狭窄模型[4-5]及自发性高血压易卒中大鼠（spontaneously hyperten⁃sive stroke prone，SHRSP）[6-7]，均仍存在很大的不足之处。易卒中型肾血管性高血压大鼠（strokeprone renalvascular hypertensive rats,RHRSP）的研究在高血压后不同时间脑组织学检查发现大鼠存在脑白质组织疏松和腔隙病灶[8]，这一动物模型中WML的发病与人类发病过程均有高血压的基础。因此，我们的研究采用RHRSP模型，观察脑白质病理改变及探讨高血压所致TJ损坏在高血压性WML发病中可能的机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 健康雄性SD大鼠90只，体质量60～90 g,由广东省实验动物中心提供。随机分为假手术组和高血压4周、8周、12周、20周、30周组，每组15只。

1.2 易卒中型肾血管性高血压大鼠（RHRSP）模型制作与血压测量 按已定型的双肾双夹法[8]复制RHRSP。假手术组未钳夹肾动脉。不同时间点用ML866 Powerlab 4/30型大鼠血压计（AD Instru⁃ments Pty Ltd，澳大利亚）经尾动脉测定收缩压。

1.3 WML分级 10%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后经左心室向主动脉插管，剪开右心房，快速灌注4℃生理盐水100mL，至右心房流出清澈无血性液体后再以200mL 4%多聚甲醛+0.1mmol/L PBS溶液（pH7.4，4℃）固定脑组织，开颅取脑，后固定24 h，梯度蔗糖脱水；OCT包埋后行冰冻切片，片厚10μm，HE染色光镜检查进行脑白质病变分级，评估脑白质的4个区域：胼胝体、尾核、外囊、内囊；分级参照Wakita等[9]分级法，即0级：正常；1级：神经纤维缠结；2级：明显的空泡形成；3级：有髓神经纤维消失。

1.4 透射电镜观察TJ 大鼠麻醉后，经左心室向主动脉插管，剪开右心房，快速灌注4℃生理盐水100mL，再以2%多聚甲醛、2.5%戊二醛混合液500mL灌注后开颅取脑，将脑白质胼胝体取出并置于后固定液中。按照标准的电镜操作过程制作半薄、超薄切片，铀铅双染后在80 kV条件下用JEM-1200EX型透射电镜观察血脑屏障超微结构改变情况。

1.5 间接免疫荧光检测白蛋白渗出 枸橼酸中抗原修复,正常兔血清室温孵育90 min。滤纸吸干封闭血清,滴加经抗体稀释液稀释的绵羊抗albumin抗体（LSBio），4℃湿盒孵育过夜。0.01 mol PBS(pH7.4)漂洗 5 min×3 次，滴加 FITC标记兔抗绵羊二抗（Bioworld），避光孵育60 min，漂洗5 min×3次，抗荧光淬灭封片，荧光显微镜观察并照相。

1.6 Loyez神经纤维染色 冰冻切片放入4%铁明矾水溶液24 h,多次蒸馏水洗，用新配的碳酸锂苏木素染液染24 h,0.5%盐酸乙醇分化10 s,充分流动水洗，使之返蓝。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察。

2 结果

2.1 RHRSP模型血压监测结果 RHRSP血压逐渐升高。与假手术组比较，术后4周、8周、12周、20周、30周组血压明显升高（P＜0.05）；模型组术后4周、8周血压较前明显升高（P＜0.01），而术后12周、20周、30周血压差异不明显（P＞0.05），12周后血压趋于平稳（表1）。

2.2 WML分级 RHRSP模型组WML随着时间延长加重。胼胝体、尾核、外囊、内囊区域都可观察到相应病理变化。与假手术组相比，术后4周开始出现轻度的病变（P＞0.05），8周始胼胝体病变明显（P＜0.05），随后加重，尾核、外囊、内囊逐渐受累；术后组间比较，20周时胼胝体病变较前显著（P＜0.05），其余3个区域在各个时间点均较前没有显著差异；病变最明显的部位在胼胝体（表2）。

2.3 BBB超微结构观察 假手术组TJ完整，血管形态平滑。RHRSP4周及8周组相邻内皮细胞间吻合紧密，TJ连续；12周时27个TJ中8个连续性破坏，基底膜增厚；20周时24个TJ中9个连续中断，血管明显扭曲，细胞器明显肿胀，细胞内空泡形成；30周时20个TJ中有11个断裂（图1）。

2.4 脑白质白蛋白漏出间接免疫荧光结果RHRSP 4周、8周、12周组脑实质及血管周围未见血浆白蛋白漏出；20周组胼胝体可见吞噬白蛋白的胶质细胞，血管周围白蛋白荧光增强；30周组可见颗粒状白蛋白漏出，遍及脑实质，白质区域以胼胝体及尾核漏出最明显，血管周围白蛋白漏出较前减少（图2）。

2.5 Loyez神经纤维染色结果 Loyez神经纤维染色显示假手术组大鼠神经纤维排列整齐、紧密。与假手术比较，RHRSP 4周组脑白质神经纤维排列整齐；8周组出现纤维紊乱；12周组可见空泡形成；20周组脑白质可见明显的疏松，神经纤维缠结、断裂；30周组疏松较前加重（图3）。脑白质疏松最明显的区域在胼胝体。

表1 RHRSP不同时间点血压（mmHg）变化情况

表2 不同时间点脑白质病变分级结果

图1 血脑屏障超微结构形态改变（46000×） A：RHRSP 4周组相邻内皮细胞间吻合紧密，紧密连接连续(▼示）；B：RHRSP 8周组紧密连接完整（▼示）；C：RHRSP 12周组紧密连接连续性中断（➡示）；D：RHRSP 20周组紧密连接连续性中断（➡示），血管明显扭曲；E：RHRSP 30周组紧密连接断裂（➡示）F：假手术组紧密连接完整连续（▼示）

图3 Loyez神经纤维染色观察（200×）A:RHRSP 4周组神经纤维排列整齐B：RHRSP 8周组神经纤维排列紊乱C：RHRSP 12周组神经纤维排列紊乱，空泡形成（➡示）D：RHRSP 20周组脑白质明显疏松，神经纤维缠结、断裂（➡示）E:RHRSP 30周组脑白质疏松较前加重（➡示）F：假手术组神经纤维排列紧密、整齐

3 讨论

WML是影像学诊断，对55岁以上的无神经精神症状的健康老年人行MRI检查，发现13.9%存在3级以上的重度WML[10]。其病理学上表现为髓鞘脱失、星形胶质细胞增殖、小胶质细胞激活。它既反映了正常老龄化过程中的神经退行性改变，又存在与不同程度的小血管病变相联系的病理改变,日益得到重视。

国外常采用双侧颈动脉狭窄模型研究WML，但与人类的发病过程相差甚远，完全没有考虑到年龄和血压的影响。SHRSP虽然接近人类的生理，但是来源少，价格贵，限制了其应用。深入探讨WML发病机制，需要找到更适用的动物模型。RHRSP常被应用于脑卒中研究，而我们发现，RHRSP也是适用的WML动物模型，首先，通过夹闭双侧肾动脉诱导的慢性进行性高血压，进而诱发脑白质病变，与人类的发病过程，即慢性高血压性脑白质病变发病过程相似；其次，病理染色显示病程中出现脑白质疏松、胶质细胞增生、神经纤维缠结、缺失，与WML病理改变相符。我们的模型中病变最明显的部位在胼胝体，这与双侧颈动脉狭窄模型一致[11]，考虑与此区域供血血管来自于脉络膜动脉或豆纹动脉终末支，与来源于大脑表面的血管相互之间的吻合稀疏或缺如有关。因此，当发生脑缺血或低灌注时，该区域极易发生缺血性改变。

高龄和高血压是脑白质病变发病最重要的危险因素。高血压患者中，脑血管阻力增大、脑血管自动调节功能下降与WML严重性相关[12]，脑血流动力学的改变参与WML形成。本研究中高血压12周前血压升高迅速，却未见明显病变，12周后血压相对平稳,此后才出现明显的病变。推测单纯高血压并不一定会造成大鼠WML，至少要12周后，血管内皮受到一定程度损伤，通过系列病理变化，才会出现明显的WML。综合病变分级，我们的研究支持高血压与WML密切相关，可以促成其发生发展。这为临床上对伴有高血压的患者必须合理控制血压提供依据。

BBB严格调控脑内微环境。脑白质缺血损害患者脑脊液白蛋白数量明显增加[13]，而脑脊液白蛋白指数是BBB受损的一个标记，提示白蛋白通过受损的BBB渗漏到脑脊液中。动物实验发现通过双侧颈动脉狭窄制备的大鼠WML模型出现明显BBB破坏[11,14]。夹闭单侧颈总动脉的SHRSP模型术后出现明显IgG渗漏伴出血，提示屏障的损坏[15]。病理学研究还发现内皮细胞激活和因此而导致的BBB破坏是脑小血管病包括脑白质病变在内的主要特征[16]。BBB破坏后，一些大分子物质包括蛋白、细胞因子等进入血管壁、血管周围间隙以及脑组织造成功能损害和毒性，可能是WML的发病机制[17]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）作为内肽酶家族的一员，有下调细胞外基质的作用，其中MMP-2在慢性脑内低灌注状态下BBB的破坏中起着重要的作用，双侧颈动脉狭窄大鼠通过腹腔注射MMP-2抑制剂AG3340及对MMP-2基因敲除的小鼠进行观察发现抑制MMP-2的表达可以通过减轻BBB破坏，进而改善WML[18]。研究表明可以用放射示踪剂及大分子标记物如辣根过氧化物酶或伊文氏蓝检测BBB渗漏，而我们采用直接的白蛋白免疫荧光，发现病程中出现明显的白蛋白漏出且逐渐增多，并且发现吞噬白蛋白的胶质细胞，而且电镜下TJ损坏逐渐增加，伴WML加重。进一步支持BBB破坏在脑白质损伤过程中可能起一定作用。我们认为，BBB破坏，可使血浆中的蛋白等成份渗出至脑组织中，可以产生神经纤维毒性作用，从而引起WML的发病。

总之，我们的研究显示RHRSP模型是研究高血压性WML的适用模型；长期高血压可以破坏BBB的TJ，从而引起血浆白蛋白的漏出，造成神经毒性，引起WML。说明BBB如何破坏，如何引起WML的具体机制仍需进一步探讨。

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