IGF-1对Alzheimer大鼠认知功能和海马Aβ1-40表达的影响1）

孟 佳，朱秀英，王秋军，李 颖，李 静，宋芳芳，姜礼红

阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease，AD）在老年人群中患病率、致残率以及致死率都很高［1］。给家庭和社会带来的负担非常严重。现有各种治疗手段，均为依据相应病因和发病机制假说而进行的尝试。AD发病机制中已经被广为接受的一种观点是：脑中淀粉样斑块积聚是引发AD系列病理改变的触酶［2］。这种包括淀粉样蛋白β（amyloidβ，Aβ）的老化斑块是 AD的神经病理标志，并且是AD的突出病理特征，Aβ淀粉样蛋白的神经毒性可能是导致AD痴呆重要原因之一，寻找使Aβ减少的特殊药物，则是一种“治本”的方法［3］。

在不断探索AD的过程中，胰岛素样生长因子-1（insulinlike growth factor-1，IGF-1）走入了研究者的视野，并成为目前前景广阔的治疗AD的候选因子［4，5］。IGF是一种多功能细胞增殖调控因子［6］，因其化学结构与胰岛素原类似而得名，IGF系统主要包括两种多肽，IGF-1与胰岛素原60%同源，IGF-2与胰岛素原40%同源。IGF-1对细胞正常生长和发育、骨再建、胚胎发育、神经生长、肿瘤免疫、防止脑损伤等方面起着十分重要的作用。已有研究表明，IGF-1对维持神经元的存活、生长、分化及神经损伤后的修复与再生具有十分重要的作用，AD病人脑内IGF-1的改变可能与AD的发病有一定的关联［7］。为进一步探讨IGF-1对AD的保护作用，本实验利用大鼠AD模型，皮下注射IGF-1作为干预，对大鼠认知行为、病理以及海马区Aβ1-40表达进行观察，为合理应用IGF-1治疗AD提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 Aβ1-40（美国Sigma公司提供），大鼠脑立体定位仪（STW-1三维推进器，成都仪器厂），数显电热恒温水浴箱（HH.W21.600S，上海跃进医疗器械厂），Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所），摄影显微镜（OLYMPUS U-SPT型），重组IGF-1（英国Peprotech EC公司），抗Aβ1-40多克隆抗体（美国Sigma公司提供），免疫组化检测试剂盒（武汉博士德公司）。

1.2 实验动物和分组 健康雄性Wister大鼠（黑龙江省哈尔滨兽医研究所提供），体重300g±20g，分笼饲养，每笼8只。将大鼠随机分为4组，每组8只。模型组；立体定向双侧海马CA1区注射Aβ1-40；正常对照组：不进行任何处置；盐水治疗组：造模1d后每日08：00给予生理盐水（1mL／kg）腹部皮下注射，用药21d；IGF-1组：造模1d后每日08：00给予IGF-1（50μg／kg）腹部皮下注射，用药21d。根据文献［8］及预试验结果选择此给药剂量。

1.3 Aβ1-40的预处理 用无菌生理盐水将 Aβ1-40稀释成2μg／μL，置入电热恒温箱37℃孵育1周，使其变为凝聚态的Aβ1-40。

1.4 AD动物模型的复制［9］手术大鼠经10%水合氯醛（3 mL／kg）腹腔注射麻醉，颅顶部沿纵轴切一纵向切口（约1.5 cm）达颅骨，参照大鼠脑立体定位图谱［10］，开颅暴露硬脑膜，向海马内缓慢注入凝聚态Aβ1-405μL。常规饲养。IGF-1组给予IGF-1皮下注射，术后14d，作行为学检测，术后21d取脑做病理学观察和免疫组化。

1.5 行为学检测（水迷宫） 设定训练时间已到，计算机停止跟踪并记录下游泳轨迹，自动计算出动物在水池中所游过的路程、找到平台所需的时间（即潜伏期）及初始角度（入水瞬间大鼠身体长轴与入水点平台连线之间的夹角）。分别记录大鼠潜伏期，并记录每只大鼠在2min内经过平台的次数以及在平台所在象限内逗留的时间（空间探索试验），作为评价大鼠学习成绩的指标。大鼠的潜伏期越短而定向航行、空间探索指标越大，则这只大鼠越聪明。

1.6 病理学观察 行为学测试后进行心血管灌注固定法。冠状切面经固定、石蜡包埋，连续冠状组织切片，分别行HE、刚果红染色及免疫组化。

1.7 免疫组织化学检查 免疫组化染色采用PV二步法。

1.8 图像分析 以海马神经细胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒沉着为阳性结果。每组取8张脑片，每个视野计数100个细胞，计算出各个视野中阳性细胞数，取其均值。

1.9 统计学处理 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 13.0分析。

2 结 果

2.1 定向航行试验 大鼠造模14d后，用Morris水迷宫法检测。定向航行试验结果在5d的训练中，4组逃避潜伏期均不断缩短，且从第3天开始，大鼠逃避潜伏期IGF-1组与正常组相比无统计学意义，与模型组、盐水组相比有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。

表1 大鼠空间定向航行能力（逃避潜伏期）（x±s）s

2.2 空间探索试验 （见表2） 在5d训练结束后，于第6天撤去站台，以大鼠穿越站台次数及大鼠在第Ⅲ象限活动时间作为衡量记忆好坏指标，模型组穿越站台次数比正常组少55%，模型组大鼠在第Ⅲ象限活动时间比正常组少40%，与盐水组相似，IGF-1组与正常组比较无统计学意义（P＞0.05）。

表2 大鼠空间探索能力（x±s）

2.3 Aβ1-40海马注射后局部病理改变 光镜下正常组大鼠海马区未见神经元损伤，神经元排列规则、紧密、形态完整。模型组及盐水对照组大鼠海马区注射点附近可见颗粒细胞带明显受损，局部神经元大量缺失，细胞排列疏松紊乱，部分细胞缺失，注射点附近出现弥漫性胶质细胞反应，细胞增生、聚集，核小深染，成扁圆形，判断为胶质细胞增生，锥体细胞数量较对照组明显减少。IGF-1注射组颗粒细胞带轻度受损，神经元排列尚规则，与模型组之间有明显差异。刚果红染色模型组可见细胞排列紊乱，胞浆内可见深染，提示为淀粉样蛋白聚集，正常组染色较浅，细胞排列规则，且胞浆未见异常改变，IGF-1组染色较浅，细胞形态完整，接近正常组。

2.4 海马CA1区Aβ1-40的表达 模型组及盐水对照组海马CAl区可见大量棕褐色阳性细胞，胞质及轴突、树突均清晰着色，正常组大鼠海马CA1区偶见Aβ1-40免疫阳性神经元；同拟AD模型组比较，IGF-1组大鼠海马CA1区Aβ1-40免疫阳性神经元明显减少或消失（P＜0.01）。详见表3。

表3 各组海马CA1区Aβ1-40免疫阳性神经元比较（x±s）

3 讨 论

AD是一种以慢性进行性记忆、认知等智能障碍为主要临床表现、与增龄相关的中枢神经系统（CNS）退行性疾病，其典型的病理变化是脑内出现大量的因β-淀粉样蛋白积聚所形成的老年斑、因tau蛋白异常磷酸化导致的神经元纤维缠结和神经元丢失等。海马作为边缘系统的重要组成部分，是近记忆回路的重要结构，是学习记忆的重要解剖基础和神经中枢，CA1在学习、记忆中担负重要作用［11］，海马与机体衰老、阿尔茨海默病及癫痫发作有着非常密切的关系［12］。

IGF-1及其受体能调节乙酰胆碱的合成与释放［13］，抑制蛋白的高度磷酸化，从而揭示了IGF-1影响认知功能的可能机制。在老年动物中枢神经系统中，尤其是海马结构中IGF-1表达呈年龄相关性下降，而IGF-1有着类似于神经生长因子（NGF）的促进神经突触形成和维持神经细胞功能的作用，可改善老龄动物的记忆学习能力［14］。相反，给予IGF-1抗体的大鼠学习记忆能力显著下降。2000年Guan等［15］证实外源性IGF-1可增强并维持海马区胆碱乙酰转移酶活性，故推测IGF-1通过催化乙酰胆碱的形成，保护胆碱能神经元，改善脑功能，IGF-1在以智能丧失和行为异常为主要表现的老年性痴呆的治疗中可能具有一定的临床价值。Tham等［16］发现AD患者血清IGF-1水平较正常人明显升高，血清IGF-1水平的升高是AD患者IGF缺乏敏感性的一种代偿。Murialdo等［17］认为AD患者血清IGF-1较正常为低。

本实验采用海马微量注射凝聚态Aβ1-40的方法建立拟AD大鼠模型，对注射部位、注射量及注射药物的孵化作了改进，本实验评价学习记忆障碍的设备是带摄像装置及分析软件的水迷宫，实验数据不受任何人为因素的影响，更为客观、真实可靠。本实验发现，拟AD大鼠模型组大鼠的学习记忆能力明显下降，而应用IGF-1后，大鼠在定向航行试验、空间探索试验中学习记忆能力明显改善，表明IGF-1具有改善AD大鼠学习记忆的作用。在海马HE、刚果红染色方面，模型组表现颗粒细胞带明显受损，局部神经元大量缺失，细胞排列疏松紊乱，部分细胞缺失，注射点附近出现弥漫性胶质细胞反应，IGF-1组颗粒细胞带轻度受损，神经元排列尚规则。IGF-1皮下注射3周的拟模型大鼠，与模型组比较，CA1区Aβ1-40表达明显减少或消失，提示IGF-1具有改善拟AD模型大鼠脑组织病理改变及降低Aβ1-40表达的作用，在实验中，设立了盐水治疗组，结果显示生理盐水对治疗没有影响。据此推论，IGF-1皮下注射拟 AD模型大鼠使Aβ1-40表达减少可能是大鼠学习记忆能力改善的机制之一，临床上尚缺乏足够资料，需要进一步验证，对IGF-1的深入研究是探讨人类认知障碍机制的重要途径之一。

尽管IGF-1真正用于临床治疗AD还需要克服很多难题，但是随着神经科学和分子生物学的快速发展，相信不远将来IGF-1治疗AD的策略能够取得长足进展，可能成为一种有吸引力的新的治疗手段。

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