片仔癀对局灶性脑梗死大鼠水通道蛋白4（AQP4）表达的影响1）

李 倩，黄希艳，朱陵群

脑血管病是目前发病率极高的一类疾病，具有三高一低的特点。脑水肿是其发展过程中的重要病理环节，可致颅内压升高，甚至形成脑疝，导致死亡，严重影响着该病的预后。脑水肿即中枢神经系统的水液代谢失常，目前常用的治疗方法包括渗透性脱水及外科手术减压等。本文着眼于片仔癀在缺血性脑血管病所致脑水肿领域的应用，并对其作用机制进行探索。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级SD大鼠，雄性，体重260g～280g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证编号：SCXK-（军）2007-004。水通道蛋白4（AQP4）试剂盒及DAB显色试剂盒，均购置于武汉博士德生物工程有限公司。尼莫地平片：拜耳医药保健有限公司，国药准字：H20003010，产品批号：BJ00604，规格：每片含30mg；脑得生片：广东国医堂制药股份有限公司生产，批号：110101，糖衣片，片芯重0.3g，每盒72片；片仔癀，漳州片仔癀药业股份有限公司，批号：0711050；

1.2 实验方法 随机将大鼠分为模型组，假手术组，片仔癀大中、小剂量组，尼莫地平组和脑得生组，每组动物10只。除假手术组外，其余各组均采用改良的Longa方法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑梗死模型（MCAO）。分离出颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），结扎ECA及CCA近心端，动脉夹暂时夹闭ICA远心端，用虹膜剪在CCA做一小切口，将事先制备好的尼龙线栓通过此小口插入CCA，松开动脉夹，使线栓经CCA插入到ICA，并顺ICA推进（18～22）mm，稍遇阻力即止，即可造成大脑中动脉血流阻断，结扎ICA固定栓线，缝合皮肤。手术结束后每只大鼠给予4×105U青霉素腹腔注射防止感染。动物清醒后2h进行神经功能学评分（依据Longa评分标准），1分～3分纳入标准。

1.3 给药方法 各组造模前给药3d，第4天给药30min后开始造模，造模后给药观察至第7天。尼莫地平片1.08mg／100（g·d），脑得生组48.6mg／（100g·d），片仔癀大剂量组48.6 mg／100（g·d），片仔癀中剂量组16.2mg／（100g·d），片仔癀小剂量组5.4mg／100（g·d）。模型组和正常组每天注射等体积的生理盐水，各组均每日给药一次，每2天称一次体重，重新计算每只动物的给药量，直到取材当日。

1.4 取材与制片 各组大鼠行为学观察之后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，断头取脑，留取梗死侧大脑皮层。将脑组织置于10%的甲醛溶液中24h，常规脱蜡、浸蜡、包埋，制成切片放在载玻片上，常温保存。

1.5 免疫组织化学染色 采用PV两步法，切片经二甲苯、梯度酒精常规脱蜡至水；去离子水冲洗5min，0.01mol／LPBS（pH 7.4）冲洗5min；0.01mol／L枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中微波热修复15min；恢复室温后0.01mol／L PBS（pH 7.4）冲洗3 min×3次；3%过氧化氢（H2O2）室温避光孵育15min阻断内源性过氧化物酶活性；0.01mol／L PBS（pH 7.4）冲洗3min×6次；滴加一抗AQP4（兔抗大鼠，1∶50），4℃冰箱过夜（不少于16h）；第二天恢复室温后0.01mol／L PBS（pH 7.4）冲洗3min×6次；滴加 HRP标记二抗，37℃孵育30min；0.01mol／L PBS（pH 7.4）冲洗3min×3；滴加新鲜配制的DAB显色试剂，避光显色，自来水终止显色；常规升梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；显微镜观察。

1.6 统计学处理 将已经染好的切片置于显微镜下，于梗死周边区随机选取5个视野，采用SPOT-Ⅱ数码成像系统、Meta-Morph图像分析系统计算AQP4的阳性信号光密度值。用SPSS 13.0统计。数据经正态分布及方差齐性检验后进行单因素方差分析，结果用均数±标准差（x±s）表示。

2 结 果

AQP4主要表达于星形胶质细胞、脑表面的软脑膜、脑室系统的室管膜、脉络丛、下丘脑的视上核和室旁核。AQP4免疫阳性细胞主要分布于梗死周边区。脑缺血后AQP4表达明显升高。与假手术组比较，片仔癀各剂量组表达有所升高（P＜0.05）。与模型组比较，各给药组表达均显著下降（P＜0.05）。片仔癀各剂量组较尼莫组、脑得生组表达有所下降（P＜0.05）。片仔癀各剂量组之间无统计学意义，中剂量组较大剂量组、小剂量组表达降低。详见表1。

表1 各组大脑皮层梗死周边区AQP4表达（x±s）

3 讨 论

中枢神经系统的正常功能与水液的代谢有着极为密切的关系。脑缺血缺氧发生后，脑水肿的发生给该病的预后带来了极为不良的影响。目前脑水肿就其发病机制而言可分为四种：包括血管源性脑水肿、细胞毒性脑水肿、间质性水肿和渗透压性脑水肿［1］。而缺血性脑血管病所导致的脑水肿以细胞毒性水肿为主，疾病后期亦包括血管源性水肿。

人们最先认识到水液代谢是以简单扩散的形式来完成跨膜转运的，直到1988年人们偶然发现了一种具有选择性水通透功能的蛋白，并于1997年将该蛋白正式命名为水通道蛋白。目前已发现13种水通道蛋白家族成员（AQP0～AQP12）［2］，其中有6种分布于中枢神经系统。AQP4于1994年被发现，其广泛分布于中枢神经系统、呼吸系统、消化系统及泌尿系统等，具有广泛调节水液代谢的作用［3］。是脑组织中含量最多、分布最广泛、发现最早的汞不敏感性蛋白［4］，其在脑内主要分布于中枢胶质界膜、室管膜等及脑表面的软脑膜、脑室系统的室管膜、脉络丛、下丘脑的视上核和脑微血管等脑-脑脊液和血-脑脊液的接触面上［5］。AQP4在星形胶质细胞极化表达，其在靠近蛛网膜下腔、血管周围的细胞表面及其终足紧密包绕毛细血管壁形成的胶质界膜上表达明显，猜测其构成了血脑屏障的第二道隔膜，从而起到调节水液代谢的作用［6］。AQP4为处于持续开放状态的膜通道蛋白，除水之外不转运其他小分子物质，可通过神经内分泌系统调控体内及中枢神经系统的水液代谢，与脑水肿的形成和消退关系密切［7］。且该蛋白具有高度快速转运水的能力，比其他水通道蛋白对水的通透性高3倍～4倍 ，故而在体内水液代谢过程中发挥着不可替代的作用。

AQP4在不同机制的脑水肿中所发挥的作用是不同的。血管源性脑水肿中水液进入脑组织并不依赖于AQP4，而需要其帮助清除过多的水液。水肿的吸收途径有以下三种：蛛网膜下隙、脑室和血管内［8］。而细胞毒性脑水肿中，细胞外的水分经高表达的AQP4进入细胞内而形成水肿。本实验结果与其作用机制相吻合。目前在分子、基因水平上对于水液在细胞内、外的运转以及调控机制尚不完全了解，对于AQP4的作用机制及生物特性尚未完全知晓，有待于进一步探索。

中医认为阴阳失调，气血逆乱，上冲于脑则发为中风。血脉不通必然引起水液代谢失常，水液停聚脑窍则神昏，神机失用。目前常用的治疗方法包括活血化瘀、醒脑开窍等。片仔癀为国宝名药，其已公开的中药成分为牛黄、三七、蛇胆、天然麝香等多种天然名贵药材，具有清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛之功效。麝香辛温，开窍醒神，李时珍的《本草纲目》谓其可“通诸窍之不利，开经络之壅遏”，是治疗脑病和其他危重疾病的常用药物［9］。三七的主要成分为三七皂苷，具有活血化瘀、活络通脉的作用，可增加脑血流量，扩张血管，改善微循环，抑制血小板聚集，降低血黏度，可有效改善梗死灶的供血状况并抑制其形成［10］。牛黄归心、肝经，具有化痰开窍，凉肝熄风，清热解毒的功效，具有抗炎、止血、降血脂的作用。蛇胆为蛇干燥的胆囊，具有清肺化痰镇痉、清热解毒、清肝明目、搜风袪湿的功效［11］。片仔癀在已有的研究中，其药理作用包括镇痛、抗炎、利胆、保肝、抗乙肝病毒及免疫调节作用。该药在缺血性脑血管病领域尚未有研究报道。本研究结果表明，片仔癀可通过抑制局灶性脑梗死大鼠大脑皮层梗死周边区AQP4的表达，在一定程度上起到减轻脑水肿、保护血脑屏障的作用。但该中药调节AOP4表达的具体作用机制尚不明了，需进一步研究，以期更好的应用于临床，发挥切实疗效。

参看文献：

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［3］ Moe SE，Sorbo JG，Sogaard R，et al.New isoforms of rat Aquaporin-4［J］.Genomics，2008，91（4）：367-377.

［4］ Rite I，Machado A，Cano J，et al.Intracerebral VEGF injection highly upregulates AQP4mRNA and protein in the perivascular space and glia limitans externa［J］.Neurochem Int，2008，52（4-5）：897-903.

［5］ 李慢，喻博，罗斐婓，等.创伤性脑损伤后大鼠皮层AQP4表达的变化［J］.解剖科学进展，2011，17（1）：12-15.

［6］ Papadopoulos MC，Saadoun S，Binder DK，et al.Molecular mechanisms of brain tumor edema［J］.Neuroscience，2004，129（4）：1011-1020.

［7］ 王复新，张洁，张淑萍，等.尼莫地平对大鼠脑出血周边组织AQP4表达的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2011，28（6）：501-504.

［8］ Papadopoulos MC，Manley GT，Krishna S，et al.Aquaporin-4facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema［J］.Faseb J，2004，18：1291-1293.

［9］ 夏鑫华，刘亚敏，赵光峰，等.麝香配伍冰片对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的脑保护研究［J］.中国实验方剂学杂志，2009，15（2）：42-45.

［10］ 刘新胜，崔书客.缺血性中风的中医药研究进展［J］.河南中医，2012，32（1）：129-131.

［11］ 曾惠芳，石书江，陈志维.蛇胆的本草考证与品质研究［J］.中医药信息，2010，5（27）：129.