解毒通络方含药血清对大鼠血管成纤维细胞释放ET、NO、MMP-9的影响1）

魏陵博，戎冬梅，李运伦，迟立萍，钟志欢，吉中强，焦华琛

成纤维细胞（CFs）增殖是多数心脏疾患病理改变的基础。成纤维细胞具有分泌功能，能够分泌释放内皮素（ET）、一氧化氮（NO）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等，基质金属蛋白酶（MMP）可导致细胞外基质的过度降解，ET 可诱导心肌细胞肥大和刺激胶原合成，能加重心脏经皮冠状动脉介入治疗（PCI）后再狭窄的发生，一氧化氮（NO）是保护性因子，有阻止再狭窄发生的作用。本研究用解毒通络方含药血清干预新生大鼠主动脉成纤维细胞的培养，测定培养液血清中 MMP、ET、NO的含量，初步揭示该方对再狭窄的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 1d～4d龄新生清洁级SD大鼠，雌雄不限，购自山东中医药大学实验动物中心。

1.1.2 实验药品 解毒通络方合剂组成：黄连12g，大黄3g，连翘15g，野葛根30g，水蛭6g，地龙12g。由山东中医药大学中药学院按制备合剂的常规方法制成灭菌合剂，1mL相当于生药材1g。

含药血清制备：取健康Wistar雄性大鼠12只，灌服解毒通络方合剂，每次按2mL／100g的体积给药（大约相当于60kg成人日剂量的15倍）。灌胃前12h禁食不禁水，每日1次，连续给药7d。于末次给药2h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，置无菌试管内。待凝固后37℃水浴1h，3 000r／min，离心15min，分离血清，-20℃冰箱保存备用。临用时，56℃恒温30min灭活，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。含药血清呈淡黄清亮透明液体。

卡托普利：济南东风制药有限公司产品，用DMEM／F12培养基溶解、过滤除菌，4℃冰箱保存备用。

1.1.3 主要试剂 AngⅡ、胰蛋白酶，Sigma公司产品；DMEM培养基，赛默飞世尔生物化学制品有限公司产品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品；NO酶联免疫测定试剂盒，美国R＆D公司产品；内皮素酶联免疫测定试剂盒，美国R＆D公司产品；波形蛋白单克隆抗体产品、纤维连接蛋白单克隆抗体产品、α-肌动蛋白单克隆抗体产品和SABC试剂盒，均为武汉博士德工程有限公司产品。

1.1.4 实验仪器 EL340I全自动酶标仪，美国Biotok公司产品；BB16uv／BB5060uv CO2培养箱，Heraeus公司产品；超净工作台，苏净集团安泰公司产品；XDS-1B型倒置显微镜，重庆光电公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与鉴定 采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉成纤维细胞，胰蛋白酶消化法作传代培养，倒置相差显微镜下观察并作血管成纤维细胞α-actin和Vimentin免疫细胞化学染色进行鉴定，选用4～8代血管成纤维细胞用于实验。

1.2.2 细胞分组与干预 胰蛋白酶消化制备细胞悬液，调整细胞密度为1×106／L，接种于培养板／瓶备用。经48h预培养和24h无血清培养基预处理后，随机分组。①DMSO溶媒对照组：10%FBS的DMEM培养基、1%DMSO，不加特殊处理因素；② AngⅡ组：AngⅡ终浓度为2×10-7mol／L、10%FBS的DMEM培养基；③卡托普利组：AngⅡ终浓度为2×10-7mol／L＋卡托普利400mg／L；④含药血清高、中、低、极低剂量组：AngⅡ终浓度为2×10-7mol／L＋含药血清20%、15%、10%、5%。继续培养24h，胰蛋白酶消化培养细胞。

1.2.3 细胞培养液ET、NO和MMP-9含量的测定 采用酶联免疫吸附法，具体步骤见试剂盒说明书。

1.2.4 统计学处理 实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差不齐时采用秩和检验。

2 结 果

2.1 大鼠胸主动脉成纤维细胞培养结果 CFS为贴壁生长型细胞，CFS呈长梭形或不规则多角形，细胞质透明，向外伸出2个～3个长短不一的突起，胞核比较大，细胞界限较清楚，生长排列较规律，多呈放射状、编织状或螺旋状走行。成纤维细胞α-actin和Vimentin免疫细胞化学染色，发现细胞Vimentin单抗染色阳性，胞浆中有棕黄色丝状网络及颗粒，而α-actin单抗染色表达阴性。

2.2 各组培养液中ET、NO、MMP-9水平比较（见表1）

表1 解毒通络合剂含药血清对大鼠血管成纤维细胞ET、NO、MMP-9的影响（x±s）

3 讨 论

PCI已逐渐成为治疗冠状动脉硬化性血管内狭窄的有效方法，但是，超过15%的冠状动脉支架置入患者在一年内因为支架内再狭窄而接受新的介入治疗［1］。贾国良等［2］认为PCI后冠状动脉再狭窄与冠状动脉对血管成形损伤的过度修复有关，支架置入几分钟后内膜表面就覆盖一层纤维蛋白原，并伴有血小板的黏附、聚集、活化，诱发中膜与外膜平滑肌细胞和成纤维细胞向内膜迁移、增殖，并合成大量的细胞外基质，发生基质改建，几周后被显微平滑肌细胞和纤维细胞组织代替，形成新生内膜，发生内皮化。

陈康玉等［3］指出，炎症反应参与了从早期的血管损伤到最终的内膜增生等整个再狭窄过程。

既往研究证明［4，5］，解毒通络方剂能有效减轻大鼠炎症性尾部血栓形成，能明显降低动物血清中IL-1的含量，对不稳定型心绞痛有较好的疗效，既能对抗炎症因子，又有抗血栓形成作用，符合冠状动脉支架内再狭窄的机制。本研究观察其对成纤维细胞产生MMP-9、ET、NO的作用，以期揭示对再狭窄发生的影响。

本研究显示，解毒通络方含药血清各个剂量组与卡托普利组都能显著降低大鼠主动脉成纤维细胞ET的含量，增加NO含量，ET是目前已知的体内作用最强的缩血管活性多肽，具有明确的促平滑肌细胞增殖的作用，在心血管疾病中起着重要作用，特别是与心肌纤维化有密切的关系［6］。NO具有舒张血管，抑制血小板黏附聚集的作用。有证据表明［7］PTCA／支架术后血小板生成的NO显著减少，而且NO合成酶和L-精氨酸（L-Arg）的跨膜运转也降低，NO由左旋精氨酸氧化途径产生，其合成限速酶NO调节着NO的合成与释放。

MMPs是一类锌依赖性蛋白酶家族，有20余种，主要包括MMP-1、MMP-2和 MMP-9。MMP-s是降解细胞外基质成分的主要酶类，其活性的增加能促进动脉粥样硬化形成中基质的重建。Ikeda等［8］研究表明，支架术后冠脉再狭窄组 MMP-2和MMP-9的水平均明显高于术后血管正常组，上述指标随冠脉再狭窄的加重程度进一步升高。

多项研究表明，血清MMP-9水平在冠心病心绞痛患者中明显升高，病情越重，升高越显著，血清MMP-9水平增高与冠状动脉病变程度密切相关［9，10］。本实验显示，高剂量组与卡托普利组均能显著降低MMP-9的水平，其他剂量组无此作用。

再狭窄是冠心病介入治疗后的主要远期并发症。在再狭窄的发生过程中，ET、NO、MMP-9均是重要的细胞因子。本研究观察了解毒通络法对新生大鼠CFs分泌的ET、NO、MMP-9的作用，证明解毒通络法是通过降低ET／NO值、降低MMP-9水平来实现防止再狭窄的。

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［3］ 陈康玉，严激.冠状动脉支架内再狭窄的炎症机制和抗炎治疗［J］.心血管康复医学杂志，2009，18（1）：88-90.

［4］ 魏陵博，戎冬梅，彭敏，等.解毒通络合剂治疗不稳定型心绞痛的临床研究［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2007，5（7）：568-570.

［5］ 戎冬梅，魏陵博，彭敏，等.解毒通络合剂对角叉菜胶所致大鼠血栓形成的影响［J］.中国中医急症杂志，2008，17（5）：660-661.

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［9］ 黄妍.血清 MMP-9、CRP、UA及IL-6、IL-8、TNF-α在老年冠心病诊断中的意义［J］.细胞与分子免疫学杂志，2010，26（9），923-924.

［10］ 潘轶斌，包丽芳，张怀勤.血清基质金属蛋白酶-9与冠状动脉病变程度的关系［J］.福建医药杂志，2006，28（3）：18-20.