四妙勇安汤提取物抑制巨噬细胞NF-κB活化和MMP-9分泌的初步研究1）

朱海燕，聂 波，徐 冰，刘 蓓，吴圣贤，陈立新

四妙勇安汤是用于治疗下肢动脉闭塞症和脉管炎的传统名方，由于其活血祛瘀、通络止痛的作用与冠心病心绞痛的病因病机相吻合，故在临床亦观察到其可改善冠心病心绞痛患者的临床症状［1］。本课题组前期研究已证实，四妙勇安汤对治疗冠心病不稳定型心绞痛患者临床症状具有较满意的疗效。但因原方中药量过大，给新药开发带来难度。本实验采用对易损斑块稳定性起重要作用的巨噬细胞为研究对象，通过对NF-κB活化和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）分泌的测定，探索四妙勇安汤的有效组分，为药物的下一步研发提供基础实验数据。

1 材料与方法

1.1 细胞 小鼠巨噬细胞系（RAW264.7细胞），中国医学科学院药物研究所，96孔白色底透培养板（Costa）。

1.2 试剂及耗材 640培养基，小牛血清，LPS（Sigma），MMP-9 ELISA试剂盒（Jiamay Biotech Co），水套式CO2细胞培养箱（Sanyo，日本），Safire2高速多通道连续波长酶标仪（TECAN，奥地利），Bright-Glo Luciferase荧光素酶检测试剂（Promega），48孔和96孔培养板（Costar）。

1.3 样品制备 “四妙勇安汤”提取物共8个。方法：原料药材55%乙醇提取2次，1.5h／次，得到55%乙醇提取液和残渣，55%乙醇提取液浓缩至干，水混悬，上大孔树脂，连续依次采用水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇淋洗，分别获得水部位、30%乙醇部位、60%乙醇部位、95%乙醇部位，分别减压浓缩干燥，得到筛选样品2号～5号；残渣用水提2次，1.5h／次，得到水提液，留取部分水提液浓缩至干得到样品1，其余用水混悬，上大孔树脂，连续依次采用水、55%乙醇、95%乙醇淋洗，分别获得水部位、55%乙醇部位、95%乙醇部位，分别减压浓缩干燥，得到筛选样品6号～8号。

1.4 细胞培养、造模方法和抑制率的检测 RAW264.7细胞在37℃、5%CO2及饱和湿度环境下培养于含10%小牛血清1640培养基中。将培养瓶内对数生长的RAW264.7细胞消化并计数，以10×104／well的密度接种于48孔培养板中。模型制备前，换以等体积无血清1640培养基，待筛样品与细胞预先孵育1h。模型制备时，每孔加入终浓度为5μg／mL LPS，与细胞共同作用24h，收集细胞上清，之后每孔加入50μL Bright-Glo Luciferase荧光素酶检测试剂，室温避光震荡5min，置于多功能酶标仪中，设定光化学检测程序进行检测。该模型以荧光素酶光化学值的变化直接指示样品对NF-κB-RE是否有阻断作用。因此，通过计算抑制率，可确定样品在NF-κB信号通路中对早期基因表达阻断作用的强弱。

以ELISA法检测MMP-9含量。根据ELISA说明书逐步操作，最后在酶标仪450nm处读出OD值。以标准品浓度为横坐标，以OD 450值为纵坐标，绘制浓度OD450标准曲线。根据样品的OD值从标准曲线上查出待测样品作用后的浓度，并通过与模型组比较，观察样品对MMP-9的抑制作用。

1.5 统计学处理 用SPSS13.0分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。

2 结 果

2.1 细胞上清液中MMP-9的含量测定 在正常培养的RAW264.7细胞上清中，MMP-9含量较低；LPS作用24h后，MMP-9含量显著增高。初筛结果显示，1、2、3、4、6、7、8号提取物能够降低细胞上清MMP-9含量，提示可能具有降低RAW264.7细胞中MMP-9产生及分泌的作用，故对上述7种提取物进行复筛。复筛结果显示，1、2、4号提取物在5μg／mL～100μg／mL浓度范围内能够明显降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有浓度依赖关系；3、6号提取物在5μg／mL～50μg／mL浓度范围内能够明显降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有浓度依赖关系；7、8号提取物在5μg／mL～25μg／mL范围内能够明显降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有浓度依赖关系。（注：7、8号提取物在50μg／mL时即出现细胞毒性作用，故复筛时二者浓度均未高于50μg／mL）。

表1 提取物对LPS致巨噬细胞损伤模型上清MMP-9含量的影响（x±s，n=3）

2.2 提取物对NF-κB反应原件结合抑制剂筛选模型的作用1、2、3、4、6、7号提取物对 NF-κB信号通路具有阻断作用，能够通过抑制早期基因表达而抑制该病理信号通路。（注：8号提取物在100μg／mL和50μg／mL时出现细胞毒性作用，故计算浓度未高于50μg／mL）。详见表2。

表2 提取物对NF-κB反应原件结合抑制剂筛选模型的作用（x±s，n=3）

3 讨 论

随着“动脉粥样硬化炎症反应”学说的公认，清热解毒中药已成为治疗冠心病的常用中药［2］。四妙勇安汤配伍精当，药专力宏，是最具中医配伍和用量特色的药物之一，由金银花、玄参、当归、生甘草组成，具有抑菌、消炎、促进血液循环等作用，常用于治疗气滞血瘀、静脉阻塞而发的脉管炎、血栓闭塞性脉管炎［3］。而冠心病心绞痛的基本病机是气虚血瘀，病理机制为络脉癖阻细急而痛［4］，与四妙勇安汤方证相吻合。四妙勇安汤可改善冠心病心绞痛患者的临床症状［1］。本课题组前期研究也证实，对冠心病不稳定型心绞痛患者临床症状具有较满意的疗效。

本实验采用巨噬细胞系RAW264.7细胞作为研究材料，并通过LPS刺激活化巨噬细胞。在众多的炎细胞中，巨噬细胞对斑块稳定性的作用尤为重要。活化的巨噬细胞除了是形成动脉粥样硬化病变的主要组成部分，还可在炎症因子的刺激下分泌基质金属蛋白酶，降解斑块中的胶原和细胞外基质成分，使纤维帽变薄，易于形成不稳定性斑块。其中，最主要的是MMP-9，它对细胞外基质合成与降解的平衡起重要作用，其在冠状动脉动脉壁和外周血中的增加程度与病变严重程度正相关［5］。本次实验结果显示：四妙勇安汤的1、2、4号提取物在5μg／mL～100 μg／mL浓度范围内能够明显降低LPS作用巨噬细胞系RAW264.7细胞后MMP-9的分泌，具有浓度依赖关系；3、6号提取物在5μg／mL～50μg／mL浓度范围内能够明显降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有浓度依赖关系；7、8号提取物在5 μg／mL～25μg／mL范围内能够明显降低LPS作用后 MMP-9的分泌，具有浓度依赖关系。结果提示四妙勇安汤的部分提取物可抑制巨噬细胞分泌MMP-9，因此可能具有减少斑块基质降解，稳定斑块的作用。

MMP-9主要在转录水平受NF-κB、AP-1等多种转录因子的调节［6］，目前许多学者认为NF-κB的激活是动脉粥样硬化发生、发展的始动机制之一［7］。本研究选择不稳定型心绞痛易损斑块炎症反应的核心病理环节——NF-κB，对四妙勇安汤全部连续组分进行高通量筛选，发现四妙勇安汤抑制NF-κB信号通路的有效部位分别为位1、2、3、4、6、7。其中有效部位2、3、4的IC50值较低，表明抑制效果最好。

综合MMP-9和NF-κB被抑制的结果可发现，四妙勇安汤有效部位1、2、3、4、6的作用较为安全可靠。此外，在筛选出中药有效部位的基础上进一步优化中药配伍和配比关系，对于进一步开发抗不稳定型心绞痛、稳定易损斑块有效中药具有重要意义。

［1］ 许恒忠，李金英，苏子德.四妙永安汤加味治疗冠心病心绞痛的疗效观察［J］.邯郸医学高等专科学校学报，2005，18（1）：45-46.

［2］ 吴同和.清热解毒法对不稳定性心绞痛患者C反应蛋白的影响［J］.吉林中医药，2006，26（11）：43-44.

［3］ 赖天松.中西医汇通常用方剂［M］.广州：广东科技出版社，1999：117.

［4］ 吴以岭.从络病学说论治冠心病心绞痛［J］.中国中医基础医学杂志，2001，7（4）：71.

［5］ Gough PJ，Gomez IG，Wille PT，et al.Macrophage expression of active MMP-9induces acute plaque disruption in apoE-deficient mice［J］.J Clin Invest，2006，116（1）：59-69.

［6］ Luttun A，Lutgens E，Manderveld A，et al.Loss of matrix metalloproteinase-9or matrix metalloproteinase-12protects apolipoprotein E-deficient mice against atherosclerotic media destruction but differentially affects plaque growth［J］.Circulation，2004，109（11）：1408-1414.

［7］ Zandi E，Chen Y，Karin M.Direct phosphorylation of IkappaB by IKKalpha and IKKbeta：Discrimination between free and NF-kappaB-bound substrate［J］.Science，1998，281（5381）：1360-1363.